Ipecac की ठहराव संस्कृति के दौरान अंतर्जात Auxin और सायटोकायनिन का
Summary
आकस्मिक शूटिंग phytohormone उपचार के बिना ipecac के एक नोडल खंडों पर प्रेरित किया जा सकता है । आकस्मिक गोली गठन के दौरान phytohormone गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हम अंतर्जात auxin और सायटोकायनिन द्वारा नोडल क्षेत्रों में मापा जाता है-ms/
Abstract
आकस्मिक गोली गठन आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों के प्रचार के लिए और ट्रांसजेनिक पौधों के उत्थान के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है । Phytohormone उपचार ज्यादातर प्रजातियों में आकस्मिक शूटिंग के प्रेरण के लिए आवश्यक है । चाहे आकस्मिक शूटिंग प्रेरित किया जा सकता है auxin और सायटोकायनिन (CK) के स्तर के बीच संतुलन द्वारा निर्धारित होता है । बहुत प्रयास एक explants के रूप में और प्रत्येक संयंत्र प्रजातियों में इस्तेमाल किया ऊतक में इष्टतम सांद्रता और phytohormones के संयोजन के निर्धारण में चला जाता है । ipecac में, तथापि, आकस्मिक शूटिंग phytohormone उपचार के बिना संस्कृति माध्यम में एक नोडल खंडों पर प्रेरित किया जा सकता है । यह सेल भेदभाव के लिए ipecac के अंतर्निहित प्लास्टिक की अनुमति देता है मूल्यांकन किया जाएगा । ipecac में आकस्मिक की शूटिंग के लिए प्रेरित करने के लिए, हम 24 डिग्री सेल्सियस के तहत 15 µmol m− 2 s− 1 प्रकाश की एक 14-h लाइट/10-h अंधेरे चक्र phytohormone-मुक्त B5 मध्यम पर 5 सप्ताह के लिए 0.2% gellan गम के साथ जम में के रूप में प्रसंस्कृत । आकस्मिक गोली मार गठन के दौरान phytohormone गतिशीलता की जांच करने के लिए, हम अंतर्जात इण्डोल-3-एसिटिक एसिड और खंडों में तरल CKs द्वारा क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री LC-ms/ इस विधि अंतर्जात इण्डोल-3-एसिटिक एसिड और CKs स्तर के एक सरल तरीके से विश्लेषण की अनुमति देता है । यह अंय प्रजातियों के पौधे में organogenesis के दौरान अंतर्जात auxin और CK की गतिशीलता की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) “totipotency” की अवधारणा का प्रस्ताव है, जिसके द्वारा संयंत्र कोशिकाओं को विभाजित कर सकते हैं, अंतर, और फिर भी पुनर्जीवित पूरे पौधों में विशिष्ट कोशिका प्रकार में अपने पहले भेदभाव के बाद परिपक्व पौधों1। ऊतक संस्कृति में, चाहे संयंत्र पुनर्जनन या प्रेरित किया जा सकता है नहीं संयोजन और विकास के माध्यम में लागू phytohormones exogenously की एकाग्रता से निर्धारित होता है । Skoog और मिलर पाया कि आकस्मिक शूटिंग संस्कृति मध्यम पर तंबाकू घट्टा से auxins को CKs के एक उच्च अनुपात युक्त प्रेरित किया जा सकता है, जबकि आकस्मिक जड़ों मध्यम एक कम अनुपात2युक्त पर प्रेरित किया जा सकता है । कि खोज के बाद से, ऊतक संस्कृति व्यापक रूप से आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों के प्रचार के लिए और ट्रांसजेनिक संयंत्रों के उत्थान के लिए इस्तेमाल किया गया है3। आकस्मिक गोली मारता है शिखर meristem के अलावा अंय ऊतकों से प्रेरित किया जा सकता है, ऐसे पत्तियों, जड़ों के रूप में, और नोड । Phytohormone उपचार सबसे संयंत्र प्रजातियों में आकस्मिक गोली मारता है की प्रेरण के लिए आवश्यक है । हालांकि, इष्टतम सांद्रता और संयोजन प्रजातियों और explants के रूप में इस्तेमाल किया ऊतकों के बीच से अलग है । इस प्रकार, बहुत प्रयास इष्टतम सांद्रता और प्रयोगों के लिए phytohormones के संयोजन का निर्धारण करने में चला जाता है ।
Carapichea ipecacuanha (Brot.) एल Andersson (ipecac) एक औषधीय संयंत्र है कि emetine और cephaeline जैसे उपक्षारों शामिल है, मुख्य रूप से जड़ों में4। रूट निष्कर्षों एक expectorant, एक उबकाई, और एक amoebicide5के रूप में उपयोग किया जाता है । हालांकि ipecac ब्राजील के उष्णकटिबंधीय वर्षावन में स्वाभाविक रूप से बढ़ता है, यह संस्कृति में बीज सेट अनिच्छुक है, और अंकुरण की दर जापान में बीज भंडारण के दौरान कम हो जाती है, इसके ठंडा जलवायु के साथ6। इसके बजाय, यह ऊतक संस्कृति, जिसमें आकस्मिक नोड पर गोली मार गठन के द्वारा प्रचारित है सबसे कुशल विधि7,8है । दिलचस्प है, आकस्मिक गोली मारता है phytohormone उपचार के बिना इस प्रजाति में प्रेरित किया जा सकता है8।
आकस्मिक शूटिंग callusing के बिना, लेकिन बेसल क्षेत्र में नहीं है शिखर क्षेत्र में एपिडर्मिस पर गठित कर रहे है9। यह अंतर एक नोडल सेगमेंट में ऊतक ध्रुवीकरण का संकेत देता है, जो संभवत: phytohormonal विनियमन के अंतर्गत है । ipecac संस्कृति प्रणाली आकस्मिक गोली गठन के दौरान अंतर्जात phytohormone स्तर में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठा अवसर की अनुमति देता है । यहां हम एक auxin के अंतर्जात स्तर के विश्लेषण के लिए हमारी विधि का परिचय (इण्डोल-3-एसिटिक एसिड (आईएए)) और चार CKs (isopentenyl adenine (आईपी), isopentenyl adenine riboside (आईपीआर), ट्रांस-zeatin (tZ), और ट्रांस-zeatin riboside (tZR)) नियंत्रण रेखा के उपयोग के माध्यम से एक नोडल खंडों में-ms/
Protocol
Representative Results
Discussion
organogenesis में शामिल phytohormones के वितरण की पहचान करने के लिए, पादप सामग्रियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसमें organogenesis को phytohormone-मुक्त माध्यम पर मनाया जा सकता है, क्योंकि जब phytohormones उत्प्रेरण के लिए exogenously के लिए explants लागू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एप्लाइड Toyo विभाग के श्री अकीरा मुराकामी के लिए आभारी हैं, और उनकी तकनीकी सहायता के लिए Gunma कृषि प्रौद्योगिकी केंद्र के श्री Koudai तानिगुची के. हम उनके सुझावों के लिए प्रोफेसर Shosaku Kashiwada और डॉ उमा Maheswari राजगोपालन, Toyo विश्वविद्यालय के भी आभारी हैं । इस अध्ययन के भाग में जीवन और पर्यावरण विज्ञान, Toyo विश्वविद्यालय के लिए अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
