التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب
Summary
يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على شرائح internodal من عرق الذهب بدون علاج فيتوهورموني. تقييم ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، قمنا بقياس اكسين الذاتية وسيتوكينين في قطاعات internodal قبل LC-MS/MS.
Abstract
تشكيل إطلاق النار العرضي أسلوب هام للدعوة للمحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع. عما إذا كان يمكن أن يتسبب العارض يطلق النار على تتحدد بالتوازن بين اكسين وسيتوكينين (كورونا) مستويات. يذهب الكثير من الجهد في تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس في كل الأنسجة المستخدمة اكسبلانتس وفي كل نوع من الأنواع النباتية. في عرق الذهب، يمكن فعل بيد من يطلق النار العرضي في قطاعات internodal في المتوسط الثقافة دون علاج فيتوهورموني. وهذا ما يسمح اللدونة الملازمة لعرق الذهب للتمايز الخلية التي يتم تقييمها. للحث على براعم العارض في عرق الذهب، نحن مثقف شرائح internodal في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في حلقة مفرغة الظلام الضوء/10-ح 14-ح على خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 توطد مع الصمغ جيلان 0.2 في المائة لمدة 5 أسابيع. للتحقيق في ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، نحن تقاس حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية و CKs في القطاعات السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي LC-MS/MS. هذا الأسلوب يسمح تحليل حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية ومستويات CKs بطريقة بسيطة. يمكن تطبيقها للتحقيق في ديناميات اكسين الذاتية وكورونا خلال organogenesis في الأنواع النباتية الأخرى.
Introduction
واقترح غوتليب هابيرلاندت (1854-1945) مفهوم “توتيبوتينسي”، بالنبات الذي الخلايا يمكن تقسيم والتفريق وتجديد محطات كاملة حتى بعد تلك التفرقة السابقة إلى أنواع محددة من الخلايا في النباتات الناضجة1. في زراعة الأنسجة، ما إذا كان يمكن فعل تجديد النبات أو لا يتحدد بتركيبة وتركيز phytohormones مناشئ التطبيقية في الأجلين المتوسط والنمو. وجد سكوغ وميلر يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من دشبذ التبغ في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على نسبة عالية من CKs إلى auxins، بينما يمكن الناجمين عن جذور العارض في المتوسطة التي تحتوي على نسبة منخفضة من2. منذ ذلك الاستنتاج، زراعة الأنسجة وقد استخدمت على نطاق واسع لنشر المحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا3. يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من الأنسجة عدا أرض قمية تبادل لإطلاق النار، مثل الأوراق والجذور، وإينتيرنوديس. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع النباتية. بيد أن التركيزات المثلى وتركيبات تختلف حسب الأنواع وبين الأنسجة المستخدمة ك explants. وهكذا، بذل الكثير من الجهد يذهب إلى تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس للتجارب.
يهيجون كارابيتشيا (الخبز). L. أندرسون (عرق الذهب) هو النباتات طبية التي تحتوي على قلويدات مثل اميتيني وسيفايليني، أساسا في الجذور4. مقتطفات الجذر تستخدم مقشع، قيء، وأموبيسيدي5. على الرغم من عرق الذهب ينمو بشكل طبيعي في الغابات المطيرة الاستوائية من البرازيل، أنها مترددة في وضع البذور في الثقافة، ويقلل من معدل الإنبات أثناء تخزين البذور في اليابان، مع أن المناخ الأكثر برودة6. بدلاً من ذلك، فإنه يتم نشر بزراعة الأنسجة، في تبادل لإطلاق النار العرضي الذي هو تشكيل في إينتيرنوديس7،الأسلوب الأكثر كفاءة8. من المثير للاهتمام، يمكن فعل العارض يطلق النار على في هذه الأنواع دون علاج فيتوهورموني8.
وتتشكل يطلق النار العرضي على البشرة في منطقة قمي شرائح internodal دون كالوسينج، ولكن ليس في المنطقة القاعدية9. هذا الاختلاف يشير إلى قطبية الأنسجة في قطاعات internodal، الذي على الأرجح تحت لائحة فيتوهورمونال. ويسمح نظام الثقافة عرق الذهب فرصة فريدة لتحليل التغيرات في مستويات فيتوهورموني الذاتية خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل. أعرض هنا ونحن لدينا طريقة لتحليل مستويات الذاتية اكسين واحد (حمض اندول-3-أنهيدريد (IAA)) وأربعة CKs (isopentenyl الأدنين (iP)، إيسوبينتينيل الأدنين المواد (حقوق الملكية الفكرية)، ترانس-أنها (tZ)، و عبر-أنها المواد (تزر)) في internodal شرائح من خلال استخدام LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحديد توزيع phytohormones المشاركة في أورجانوجينيسيس، من المهم أن استخدام المواد النباتية التي يمكن ملاحظتها organogenesis في المتوسط خالية من فيتوهورموني، لأنه عندما يتم تطبيق phytohormones مناشئ explants لحمل البراعم أو الجذور، وهي تؤثر explant كله، مما يجعل من الصعب تقييم اللدونة الملازمة للنباتات في تمايز ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للسيد أكيرا موراكامي من قسم العلوم التطبيقية وجامعة تويو والسيد كودي تانيجوشى المركز التكنولوجيا الزراعية جونما للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون أيضا للبروفيسور شوساكو كاشيوادا والدكتور Uma الج يجلاب، جامعة تويو لاقتراحاتهم. وأيد في مركز أبحاث هذه الدراسة جزئيا للحياة، والعلوم البيئية، جامعة تويو.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
