Kvantifiering av endogena Auxin och Cytokinin under internoden kultur Ipecac
Summary
Oavsiktlig skott kan induceras på internodal segment Ipecac utan phytohormone behandling. För att utvärdera phytohormone dynamics under oavsiktlig shoot bildandet, mätte vi endogena auxin och cytokinin i internodal segment av LC-MS/MS.
Abstract
Oavsiktlig shoot bildandet är en viktig teknik för förökning av ekonomiskt viktiga grödor och för regenerering av transgena växter. Phytohormone behandling krävs för induktion av oavsiktlig skott i de flesta arter. Om oavsiktlig skott kan induceras bestäms av balansen mellan auxin och cytokinin (CK) nivåer. Mycket arbete går in i att fastställa optimala koncentrationer och kombinationer av fytohormoner i varje vävnad som används som bladsticklingar och i varje växtarter. I ipecac, dock kan oavsiktlig skott framkallas på internodal segment i odlingsmedium utan phytohormone behandling. Detta tillåter inneboende plasticitet Ipecac för celldifferentiering utvärderas. För att inducera oavsiktlig skott i ipecac, odlade vi internodal segment vid 24 ° C under 15 µmol m−2 s−1 av ljus i en 14-h ljus/10-h mörka cykel på phytohormone-fri B5 medium solidifierats med 0,2% gellan tuggummi i 5 veckor. För att undersöka phytohormone dynamics under oavsiktlig shoot bildandet, mätte vi endogena indol-3-ättiksyra och CKs inom segmenten av flytande kromatografi-tandem mass spectrometry LC-MS/MS. Denna metod tillåter analys av endogena indol-3-ättiksyra och CKs nivåer på ett enkelt sätt. Det kan användas för att undersöka dynamiken av endogena auxin och CK under organogenes hos andra växtarter.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) föreslås begreppet ”totipotency”, av vilken växt celler kan dela, differentiera och regenerera hela växter även efter deras tidigare differentiering till specifika celltyper i mogen växter1. I vävnadskultur bestäms huruvida växten regenerering kan induceras eller inte av kombinationen och koncentrationen av exogent tillämpad fytohormoner i odlingsmedium. Skoog och Miller hittade att oavsiktlig skott kan induceras från tobak förhårdnader på odlingsmedium som innehåller en hög andel av CKs till auxins, medan oavsiktlig rötter kunde förmås på medium innehållande en låg baserat2. Sedan detta konstaterande, har vävnadsodling använts för förökning av ekonomiskt viktiga grödor och för regenerering av transgena växter3. Oavsiktlig skott kan induceras från vävnader än skjuta apical meristem, såsom blad, rötter och internoder. Phytohormone behandling krävs för induktion av oavsiktlig skott i de flesta växtarter. De optimala koncentrationer och kombinationer skiljer sig dock av arter och vävnader används som bladsticklingar. Mycket möda går således till att fastställa optimala koncentrationer och kombinationer av fytohormoner för experiment.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) är ett läkemedel som innehåller alkaloider såsom Emetin och Cefaelin, främst i rötter4. Root extrakt används som ett slemlösande, ett kräkmedel och en amoebicide5. Även om ipecac växer naturligt i tropiska regnskogar i Brasilien, det är ovilliga att ställa in frön i kultur och grobarheten minskar under utsäde lagring i Japan, med dess kallare klimat6. Istället är det förökas genom vävnadsodling, i vilket oavsiktlig skjuta bildandet på internoder är den mest effektiva metod7,8. Intressant, kan oavsiktlig skott induceras hos denna art utan phytohormone behandling8.
Oavsiktlig skott bildas på epidermis i apikala regionen av internodal segment utan callusing, men inte i den basala region9. Denna skillnad indikerar vävnad polaritet i internodal segment, vilket förmodligen är enligt phytohormonal förordning. Ipecac kultur systemet tillåter en unik möjlighet att analysera förändringar i endogena phytohormone nivåer under oavsiktlig shoot bildandet. Här presenterar vi vår metod för analys av de endogena nivåerna av en auxin (indol-3-ättiksyra (IAA)) och fyra CKs (isopentenyl adenin (iP), isopentenyl adenin riboside (iPR), trans-zeatin (tZ) och trans-zeatin riboside (tZR)) i internodal segment med hjälp av LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att identifiera fördelningen av fytohormoner inblandade i organogenesen, det är viktigt att använda växtmaterial som organogenesen kan observeras på phytohormone-fri medium, eftersom när fytohormoner exogent tillämpas på bladsticklingar för att inducera skott eller rötter, de påverkar den hela explant, vilket gör det svårt att utvärdera inneboende plasticitet av växter i celldifferentiering och organogenes. Oavsiktlig skott kan induceras på phytohormone-fri kultur media i andra växtarter såsom …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att Mr Akira Murakami av Institutionen för tillämpade biovetenskaper, Toyo universitet och Mr Koudai Taniguchi på Gunma jordbruks Technology Center för deras tekniskt bistånd. Vi är också tacksamma att Professor Shosaku Kashiwada och Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo universitet för deras förslag. Denna studie var stöds delvis av Research Center for Life och miljövetenskap, Toyo universitet.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
