דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית
Summary
מטריצה חוץ-תאית הלב (ECM) היא רשת מורכבת של מולקולות שננהל את מפתח בתהליכי רקמות ואיברים שתישא את שיפוץ פיזיולוגיים לאורך החיים. Decellularization מתוקננת לב העובר, למבוגרים היתרי השוואתי ניסיוני של שתי רקמות בהקשר תלת-ממד על-ידי לכידתו ארכיטקטורה מקורית ומאפיינים ביו-מכני.
Abstract
הידע הנוכחי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-תקשורת התא מתרגמת ללימודים רב מימדי תרבות במבחנה (2D) שבו רכיבי ה-ECM מוצגות כחלק משטח ציפוי. מערכות התרבות אלו מהווים של פישוט של האופי המורכב של הרקמה ECM שמקיף את ההרכב הביוכימי, מבנה, תכונות מכניות. לחקות טוב יותר של תקשורת ECM בעיצוב של microenvironment לב, פיתחנו פרוטוקול המאפשר decellularization של הלב העוברי לגמרי, החדר השמאלי למבוגרים רקמת explants במקביל ללימודי השוואתי. הפרוטוקול משלב את השימוש מאגר היפוטוניק, חומר ניקוי של מאפיינים anionic חומרים פעילי שטח, וטיפול DNase ללא כל דרישת כישורים מיוחדים או ציוד. היישום של האסטרטגיה decellularization אותו על פני דגימות רקמה מן הנבדקים של גיל שונות היא גישה אלטרנטיבית לביצוע מחקרים השוואתיים. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי הבדלים מבניים ייחודי על פני העובר למבוגרים לב ECM עם רשת שינוי, ביולוגיים הסלולר תגובות ו. יתר על כן, בזאת מתודולוגיה מדגים יישום רחבה יותר בהצלחה ליישם רקמות ומינים אחרים עם התאמות קלות, כגון ביופסיות במעי האדם, הריאות העכבר.
Introduction
מטריצות (ECM) היא רשת דינמית של מולקולות המסדירים חשוב תהליכים תאיים, כלומר הגורל-החלטה, התפשטות ובידול1,2. החקירה של התא-ECM אינטראקציות בוצעו בעיקר דו מימדי (2D) בתרבויות חוץ גופית מצופה עם רכיבים ECM, אשר מהווים של פישוט של מאפייני ECM יליד נמצאו vivo. Decellularization יוצר acellular bioscaffolds ECM תלת ממד זה בעיקר לשמר את אדריכלות חוץ-תאית קומפוזיציה של יליד רקמות, איברים3,4. בנוסף להיותם פיגומים ביואקטיביות עבור הנדסת רקמות, decellularized 3D ECM biomaterials מתגלים כמו פלטפורמות הרומן להעריך ביולוגיה של התא-ECM העוברים במקביל הסביבה ויוו.
הערכה של תפקיד דיפרנציאלית של רכיבי ה-ECM של רקמות שונות, איברים, גיל ייהנו עם השימוש של פרוטוקולים דומה של יצירת bioscaffolds מקורי. בלב, פיתחנו פרוטוקול רב-תכליתי עבור decellularization של העובר, מבוגר-derived דגימות, כגישה חלופית לביצוע מחקרים השוואתיים של microenvironment איברים. באמצעות מתודולוגיה זו, אנו כבשו את microenvironment לב מקורית, הראה כי העובר ECM מקדמת את תשואות גבוהות איכלוס של תאי לב5. Decellularization הוסיפה זיהוי של תושב מבניים ההבדלים בין ECM עוברית ומבוגרים ברמה של סידור רשת מטריקס פרופריה המרתף, pericellular סיבים הרכב5. לפני שזה יעבוד, עפות. השוואה של רקמות בשלבים אונטוגנית שונים, באמצעות גישה decellularization אותו רק דווח על הכליות קוף רזוס ולבבות מכרסמים. בנוסף, מספר מצומצם של מחקרים מדווחים רקמות/איבר בעובר decellularization כשלעצמה5,6,7. זו הושגה באמצעות מרחביות כסוכן decellularization ייחודי; עם זאת, ריכוז מרחביות שונות שימשו את decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים7,8. למען חברה דמוקרטית היא לאחד חומרי ניקוי יוניים היעיל ביותר לאישור של חומר cytoplasmic וגרעיני, בשימוש נרחב decellularization שונים רקמות, דגימות9,10. פתרונות המכילה ריכוז גבוה מרחביות, ממושכות של חשיפה יש היה בקורלציה עם דנטורציה של חלבונים, ואובדן גליקוזאמינוגליקן (GAGs) שיבוש קולגן הסיבים10,11, ולכן האיזון בין שימור ECM והסרת תאים הכרחי. כדי להחיל את ההליך על רקמת הלב העוברי, למבוגרים, פרוטוקול המתוארים בזאת מחולקת לשלושה שלבים רציפים: תא פירוק על ידי שוק אוסמוטי (מאגר היפוטוניק); solubilization של אינטראקציות חלבון השומנים, חלבון-דנ א, חלבון (0.2% מרחביות); הסרת חומרים גרעיניים (טיפול DNase).
פרוטוקול שלנו מראה מספר יתרונות: אני) האפשרות של decellularization המקביל של רקמות הלב גיל ספציפי על-ידי היישום של האסטרטגיה decellularization אותו; ii) שאין דרישות שיטות מיוחדות או ציוד; iii) שמוכן ההסתגלות רקמות ו מינים אחרים כמו זה יושם בהצלחה עם שינוי קטן ביופסיות במעי האדם12 ו העכבר ריאות13; ו, וחשוב, הרביעי) יכול לפנות מאפיינים biomechanical ECM תוך מתן אפשרות ההרכבה של תרבויות דמויי תלת-ממד organotypic יותר מקרוב לחקות התכונות מולקולרית של microenvironment הרקמה הטבעית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטריצות (ECM) הוא meshwork דינמיות ומורכבות מאוד של glycoproteins סיבי, דביק, המכיל מאגר של פפטידים ביו הרבות כלואה גורמי גדילה. כמו אפנן העיקריים של התא אדהזיה, שלד התא dynamics, תנועתיות/הגירה, התפשטות, התמיינות אפופטוזיס, ECM מסדיר באופן פעיל תפקוד התאים והתנהגות. בידיעה כי התנהגות הסלולר שונה בתרבויות מי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה לכל חברי מעבדה פינטו-דו-Ó לדיון ביקורתי רלוונטית. עבודה זו נתמכה על ידי MIT פרוגרמה-Fundação פארא Ciência e Tecnologia (FCT) תחת הפרויקט “מהונדסים CARDIOSTEM רקמות הלב, טיפולים מבוססי תאי גזע עבור יישומים לב וכלי דם” (MITP-טרה-בתים/ECE/0013/2013). אגש ח הוא זוכת מלגת FCT [SFRH/BD 88780 2012] והוא M.J.O. בחור FCT (FCT-חוקר 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
- Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
- Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
- Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
- Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
- Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
- Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
- Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).
