ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات
Summary
المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.
Abstract
المعرفة الحالية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)-الاتصالات خلية يترجم إلى الدراسات الكبيرة الثقافة في المختبر (2D) ثنائي الأبعاد حيث يتم عرض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة كطلاء سطح. وهذه النظم الثقافة تشكل تبسيطا للطبيعة المعقدة للأنسجة ECM التي تشمل تشكيل البيوكيميائية وهيكل وخصائص ميكانيكية. لمحاكاة أفضل الاتصالات ECM-خلية تشكيل المكروية القلب، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ديسيلولاريزيشن قلب الجنين كله وأنسجة البطين الأيسر الكبار اكسبلانتس في نفس الوقت للدراسات المقارنة. البروتوكول يجمع بين استخدام مخزن مؤقت ناقص التوتر، مطهر خصائص السطح أنيونى، ومعاملة الدناز دون أي اشتراط للمهارات المتخصصة أو المعدات. تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن عبر عينات الأنسجة من مواضيع عصر مختلف نهج بديل لإجراء دراسات مقارنة. يسمح هذا البروتوكول تحديد الاختلافات الهيكلية فريدة من نوعها عبر الجنين والكبار القلب ECM مش والبيولوجية الخلوية الردود. وعلاوة على ذلك، هذه الوثيقة يوضح منهجية تطبيق أوسع نطاقا يجري تطبيقها بنجاح في أنسجة أخرى والأنواع مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة، كما هو الحال في خزعات الأمعاء البشرية والرئة الماوس.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكة دينامية من الجزيئات التي تنظم العمليات الخلوية الهامة، إلا وهي مصير قرار،1،انتشار والتفريق2. وقد أجريت التحقيق في تفاعلات الخلية-ECM أساسا في ثنائي الأبعاد (2D) في الثقافات الأنابيب المغلفة مع مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تشكل تبسيط خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية الموجودة في فيفو. ديسيلولاريزيشن يولد اللاخلوي بيوسكافولدس ECM 3D تشبه إلى حد كبير الحفاظ على بنية الخلية وتكوين الأنسجة الأصلية والأجهزة3،4. بالإضافة إلى خدمة السقالات النشطة بيولوجيا لهندسة الأنسجة، الخارجة ديسيلولاريزيد الحيوية ECM 3D كمنصات جديدة لتقييم بيولوجيا الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة هذا التوازي المجراة في البيئة.
تقييم الدور التفاضلية لمكونات ECM أنسجة متميزة وأجهزة والعمر ستستفيد باستخدام بروتوكولات مماثلة لتوليد بيوسكافولدس الأصلية. في القلب، وقمنا بتطوير بروتوكول متعدد الاستخدامات ديسيلولاريزيشن عينات الأجنة والمستمدة من الكبار، كنهج بديل لإجراء دراسات مقارنة المكروية الجهاز. استخدام هذه المنهجية، استولت المكروية القلب الأصلي وأظهرت أن يعزز ECM الجنين غلات تعمير لخلايا القلب5. ديسيلولاريزيشن توفير مزيد من تحديد هوية المقيم الاختلافات الهيكلية بين ECM الجنين والكبار على مستوى ترتيب شبكة مصفوفة الصفيحة الطابق السفلي وبيريسيلولار والألياف تكوين5. قبل هذا العمل، أبلغ مقارنة وجها لوجه للأنسجة في مختلف مراحل التحور باستخدام نفس النهج ديسيلولاريزيشن فقط للقرد الريسوسي الكليتين وقلوب القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم عدد محدود من الدراسات الأنسجة الجنينية/الجهاز ديسيلولاريزيشن في حد ذاتها5،،من67. وقد تم ذلك باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي كعامل ديسيلولاريزيشن فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، استخدمت متميزة الحزب الديمقراطي الصربي تركيزات ديسيلولاريزيشن الجنين والكبار من أنسجة القلب7،8. الحزب الديمقراطي الصربي هو واحد من المنظفات الأيونية الأكثر فعالية لإزالة المواد النووية وحشوية، وتستخدم على نطاق واسع في ديسيلولاريزيشن لمختلف الأنسجة والعينات9،من10. المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الحزب الديمقراطي الصربي، وفترات طويلة من التعرض لها قد يرتبط تمسخ البروتين، فقدان glycosaminoglycan (الكمامات) واضطراب ييفات الكولاجين10،11، ومن ثم التوازن بين إزالة الحفاظ عليها وخلية إدارة المحتوى في المؤسسة أمر ضروري. لتطبيق نفس الإجراء على أنسجة قلب الجنين والكبار، يتم تقسيم البروتوكول الموضحة هنا في ثلاث خطوات متتابعة: خلية تفسخ بصدمة ناضح (المخزن المؤقت ناقص التوتر)؛ سولوبيليزاتيون تفاعلات البروتينات الدهنية والبروتين الحمض النووي والبروتين-بروتين (الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪)؛ وإزالة المواد النووية (الدناز المعاملة).
لدينا بروتوكول يظهر العديد من المزايا: أنا) إمكانية أي ما يعادل ديسيلولاريزيشن من أنسجة القلب سن معينة من تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن؛ ثانيا) أي متطلبات للأساليب المتخصصة أو المعدات؛ ثالثا) جاهزة التكيف للأنسجة والأنواع الأخرى كما أنها قد طبقت بنجاح مع تعديلات طفيفة في خزعات الأمعاء البشرية12 والماوس الرئة13؛ والأهم من ذلك، رابعا) يمكن معالجة خصائص النشاط الحيوي ECM حين تمكن الجمعية العامة الثقافات مثل 3D أورجانوتيبيك أكثر عن كثب تحاكي ملامح الجزيئية المكروية الأنسجة الأصلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو meshwork ديناميكية للغاية ومعقدة من glycoproteins الليفي ولاصقة، تتكون من خزان من الببتيدات النشطة بيولوجيا وفخ النمو عوامل عديدة. المغير الرئيسية التصاق الخلايا وديناميات cytoskeleton، حركية والهجرة، وانتشار، والتمايز والمبرمج، تنظم إدارة المحتوى في المؤسسة بنشاط وظيفة ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب مدينون لجميع الأعضاء في مختبر بينتو-دو-Ó للمناقشة الهامة ذات الصلة. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا Programa الفقرة Ciência ه تكنولوجيا (إقليم العاصمة الاتحادية) في إطار مشروع “المهندسة كارديوستيم أنسجة القلب والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للقلب والأوعية الدموية التطبيقات” (ميتب-السل/اللجنة الاقتصادية لأوروبا/0013/2013). A.C.S. حاصلة على زمالة إقليم العاصمة الاتحادية [سفره/BD/88780/2012] و M.J.O. وهو “زميل إقليم العاصمة الاتحادية” (إقليم العاصمة الاتحادية-المحقق عام 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
- Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
- Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
- Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
- Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
- Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
- Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
- Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).
