Eine präklinische Mausmodell der Osteosarkom, die extrazelluläre Vesikel-vermittelter Kommunikation zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen zu definieren
Summary
Direkter Einspritzung von Krebs-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) führt zur Neuprogrammierung des Knochenmarks Tumorprogression zu unterstützen; die Zellen dieser Effekt vermitteln, ist jedoch unklar. Hierin beschreiben wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur EV-vermittelten Tumor-mesenchymale Stammzellen (MSC) Interaktionen in VivoUntersuchung offenbart eine entscheidende Rolle für EV-gebildete MSCs in Metastasen.
Abstract
Innerhalb der Tumor Mikroumgebung beitragen ansässig oder rekrutierten mesenchymaler Stammzellen (MSCs) zur malignen Progression bei mehreren Krebsarten. Unter dem Einfluss von bestimmten Umweltsignale können diese adulten Stammzellen Parakrine Mediatoren führt zu beschleunigten Tumorwachstum und Metastasierung freigeben. Definieren das Übersprechen zwischen Tumor und MSCs ist von primärer Bedeutung zu verstehen, die Mechanismen der Tumorprogression und neue Ziele für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.
Krebszellen produzieren große Mengen von extrazellulären Vesikeln (EVs), die das Verhalten der Zielzellen in der Mikroumgebung Tumor oder an entfernten Standorten tiefgreifend beeinflussen können. Tumor-EVs beilegen funktionellen Biomoleküle, einschließlich der entzündlichen RNAs und (Onko) Proteine, die Stromale Zellen um die metastatische Verhalten der Krebszellen zu verbessern oder zur Teilnahme an der Pre-metastatischen Nische Bildung erziehen können. In diesem Artikel beschreiben wir die Entwicklung von einem präklinischen Krebs-Maus-Modell, die spezifische Auswertung an die EV-vermittelten Übersprechen zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen ermöglicht. Zunächst beschreiben wir die Reinigung und Charakterisierung von Tumor sezerniert EVs und die Bewertung der EV-Internalisierung von MSCs. Wir machen dann Verwendung von eine Multiplex-Perle-basierte Immunoassay auszuwertende Änderung des MSC-Zytokin-Expressionsprofil induziert durch Krebs EVs. Schließlich veranschaulichen die Generation eine biolumineszente orthotopen Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom, die die Tumor-MSC-Interaktion rekapituliert, und zeigen den Beitrag der EV-gebildete MSCs zu Wachstum und Metastasierung Tumorbildung.
Unser Modell bietet die Möglichkeit, wie Krebs EVs ein Tumor tragenden Umfeld gestalten zu definieren und zu bewerten, ob die Blockade der EV-vermittelten Kommunikation zwischen Tumor und MSCs Krebs Fortschreiten verhindert.
Introduction
Der Tumor Mikroumgebung beteiligt sich aktiv an den meisten, wenn nicht alle Aspekte der Tumorgenese und Krebs Fortschreiten, einschließlich Metastasenbildung und die Entwicklung von Resistenzen gegen Therapeutika1. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der präklinischen orthotopen Krebs-Maus-Modellen, die Dissektion der Auftritt in der Tumor-Nische komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen zu ermöglichen.
Unter den vielen zellulären Komponenten des Tumors Mikroumgebung tragen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) stark zur Krebsentwicklung bei mehreren Krebsarten wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Hirntumoren, Multiple Myelom/Plasmozytom und Osteosarkom2 ,3,4,5,6,7. MSCs sind multipotente Stammzellen, die in verschiedenen Erwachsenen und fetalen Geweben, einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Plazenta, Nabelschnurblut und andere8,9befinden. In Reaktion auf inflammatorische Signale Krebs erzeugt MSCs migrieren in Tumor Standorte, in der Tumor-Mikroumgebung integrieren und letztlich in Unterstützung von Krebs Zellen10unterscheiden. Diese Krebs-assoziierten MSCs vorsehen Tumorprogression auf Tumorzellen und auf dem umgebenden Stroma2, handeln wesentliche Faktoren (z.B. Wachstumsfaktoren, Chemokine, Zytokine und immunsuppressive Mediatoren). 3 , 11 , 12 , 13. während die Tumor-fördernde Wirkung von Krebs-assoziierten MSCs in zahlreichen Krebs-Modelle untersucht wurden, sind die Mechanismen, durch die Tumorzellen MSCs Programmieren um eine Krebs-fördernde Nische Form, schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Generation eines orthotopen Xenograft-Modells, die die Studie der Pro-tumorigenic Interaktion zwischen Knochen Krebszellen und MSCs über extrazelluläre Vesikel (EVs) ausdrücklich erlaubt.
EVs sind wichtige Mediatoren der interzellulären Kommunikation zwischen Tumor und Stromazellen Zellen14. EVs tragen funktionelle Biomoleküle der Zelle Herkunft, einschließlich Proteine, Lipide und regulatorischen RNAs. Einmal in den Extrazellulärraum freigesetzt, diese Bläschen von umgebenden Zellen aufgenommen werden können oder an entfernten Standorten über das Blut oder die Lymphzirkulation durchgeführt und zutiefst Ziel Zelle Verhalten beeinflussen können. 15 , 16 , 17 zum Beispiel Aufnahme von Krebs EVs von Stromazellen Fibroblasten Myofibroblast Unterscheidung Angiogenese Unterstützung und Beschleunigung Tumor Wachstum in Vivo18,19, Internalisierung von Endothelzellen führen Zellen können Tumor-Angiogenese stimulieren und erhöhen die vaskuläre Permeabilität16,20, und Interaktion mit Immunzellen könnte zur Unterdrückung der Immunantwort Antitumor-21.
Wir vor kurzem gezeigt, mit einer Biolumineszenz orthotopen Xenograft-Maus-Modell der Osteosarkom, dass Tumorzellen hohe Mengen des EFD freigeben, die MSCs Pro tumorigenic und Pro-metastasiertem Phänotyp zu veranlassen. Dieser Effekt wird durch eine dramatische Veränderung in der MSC Zytokin Expressionsprofil (bezeichnet als “MSC Education”) und kann durch die Gabe von einer therapeutischen Interleukin-6-Rezeptor (IL-6R) Antikörper7verhindert werden. Unsere Arbeit gezeigt, dass Krebs EVs sind entscheidende Modulatoren des MSC-Verhalten, wodurch eine Begründung für Mikroumgebung ausgerichtete Ansätze, Osteosarkom Fortschreiten zu stoppen. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll um die EV-vermittelten Tumor-MSC Interaktion in Vivozu untersuchen. Dieses Modell soll: (1) speziell definieren Krebs EV-induzierte Veränderungen des MSC Verhalten in den Tumor Mikroumgebung, 2) auszuwerten, wie diese Interaktion zu Knochen Tumorwachstum und Metastasenbildung und (3) Studie beiträgt, ob stören EV-vermittelten Übersprechen in Vivo verhindert Krebs Fortschreiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor sezerniert extrazelluläre Vesikel (EVs) verändern die Physiologie von lokalen und entfernten Mesenchymale Zellen ein Tumor-unterstützendes Umfeld zu generieren. Hier beschreiben wir die Generation von einem präklinischen Mausmodell der Osteosarkom, die Dissektion der EV-vermittelten Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen erlaubt und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Vivo. Wir zeigen, dass systemische Injektion von menschlichen Tumor EV-gebildete MSCs bei Mäusen mit Osteosarkom Xenotransplantate stark…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.R. Baglio wurde durch ein Stipendium von Associazione Italiana per la Ricerca Sul Ariete (AIRC) kofinanziert von der Europäischen Union unterstützt. Darüber hinaus hat dieses Projekt erhielt Fördermittel aus der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 660200 (, S.R. Baglio).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
References
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