Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas
Summary
Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.
Abstract
Opções atuais do tratamento para avançados e recorrente de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) Coloque a radiação e quimioterapia-radiação abordagens com ou sem cirurgia. Enquanto esquemas de quimioterapia baseados em platina, atualmente, representam o padrão ouro em termos de eficácia e são dadas na grande maioria dos casos, novos regimes de quimioterapia, ou seja, imunoterapia estão surgindo. No entanto, as taxas de resposta e mecanismos de resistência de terapia para qualquer regime de quimioterapia são difíceis de prever e permanecem insuficientemente compreendida. Grandes variações dos mecanismos de resistência a quimioterapia e a radiação são conhecidas até à data. Este estudo descreve o desenvolvimento de um ensaio padronizado, elevado-throughput em vitro para avaliar a resposta da linha celular HNSCC para diferentes regimes de terapia e espero que em células primárias de pacientes individuais como futura ferramenta para tumor personalizado terapia. O ensaio é projetado para ser integrado o algoritmo padrão de controle de qualidade para pacientes com HNSCC em nosso centro de atendimento terciário; no entanto, este será o tema de estudos futuros. Viabilidade técnica parece promissor para as células primárias de biópsias de tumor de pacientes reais. Amostras são então transferidas para o laboratório. Biópsias são mecanicamente separadas seguido por digestão enzimática. Então, as células são cultivadas em frascos de cultura de células de ultra baixa adesão que promovem a formação reprodutível, padronizada e espontânea dos conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Esferoides então estão prontos para ser exposto a protocolos de quimioterapia-radiação e protocolos de imunoterapia conforme necessário. O tamanho de viabilidade e esferoide de final de célula são indicadores de susceptibilidade de terapia e, portanto, poderia elaborar-se em consideração no futuro para avaliar a resposta do provável terapia dos pacientes. Este modelo pode ser uma ferramenta valiosa, custo-eficiente para terapia personalizada para câncer de cabeça e pescoço.
Introduction
Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é o sexto mais comum de câncer em todo o mundo com uma incidência crescente de patogénese associada a infecção da mucosa papilomavírus humano (HPV), ao lado de uma maioria de casos causados por álcool e nicotina excessiva consumo de 1,2. Enquanto tumores menores e estágios pre-invasoras são geralmente bem tratáveis com excisão cirúrgica, geralmente combinado com dissecação de linfonodo cervical, o tratamento para estado avançado e recorrente HNSCC permanece desafiador devido à invasão de tumor agressivo com disseminação metastática e resistência à radiação e quimioterapia protocolos3,4,5,6,7,8. Estudos recentes sugerem uma alta variabilidade do fenótipo celular e caracterização sub circulantes e células tumorais disseminadas começou9,10. A crença anterior de um tumor sólido, uniforme massa teve que ser revisto à luz dos recentes estudos nos últimos anos11,12,13,14. As abordagens atuais para caracterização do tumor e identificação das principais mutações poderiam identificar vários genes que parecem estar associadas com resistência à terapia, mas permanecem uma abordagem de custo elevado. Além disso, conhecimento do genótipo não necessariamente permite uma previsão confiável do fenótipo e sua resposta de tratamento.
Tem havido alguns avanços na melhoria da sobrevivência global e livre de doença para doença estado avançado e recorrente. Nicotina – bem como carcinoma de vírus associado, opções atuais do tratamento além de cirurgia juntar radiação agressiva e esquemas de quimioterapia baseados em platina. Há implicações para as taxas de resposta diferente entre carcinoma de HPV-negativas e positiva; no entanto, isso ainda não conduzir a uma mudança em geral orientações de terapia. Resistência à radiação e a quimioterapia é um fenómeno frequente em todas as fases do tumor e existe para baseada em platina quimioterapia bem como quanto à terapia-alvo (Anti-EGFR; receptor de fator de crescimento epidérmico) e recentemente emergentes de inibição posto15. Quimioterapia e radioterapia ineficaz têm um custo elevado de morbidade paciente significativo em termos de disfagia, mucosite, boca seca e risco de diminuição da função renal ou cardíaca, entre outros. A decisão de um conceito geral de terapia para cada paciente individual prevendo antes da resposta terapêutica parece ser o objetivo crucial, impedindo os conceitos de tratamento desnecessário, efeitos colaterais e custos.
Procuramos estabelecer um modelo para testar a susceptibilidade de tratamento individual do paciente para o atual padrão quimioterapia radiação-que poderia ser integrada o algoritmo de tratamento oncológico regular e controle de qualidade de um ponto técnico permanente. A meta distante foi usar o modelo sem usar linhas de células fortemente alterado e envelhecido, como mal representam as células de tumor humano real sem sua variabilidade e a heterogeneidade como sabemos agora, enquanto o estabelecimento do protocolo foi feita em várias linhas de células. Para ser independente apenas a partir de linhagens celulares disponíveis comercialmente, recentemente com sucesso geramos uma linha de celular intermediário chamada “PiCa” de células HNSCC primárias de espécimes de tumor humano com marcadores celulares conservadas na suas superfície e limitadas de passagens 16. linha de celular essa PiCa deve servir como uma preparação para o desenvolvimento do modelo na estrada para depois mais tarde após testes com células cancerosas humanas frescas de biópsias de tumor. Tem sido demonstrado que as células em uma célula tridimensional culturas reagem de forma diferente e mais na vivo-como a administração de drogas de câncer do que aquelas crescendo em monocamadas17,18,19,20 ,21, devido principalmente à conservação de migratórias e propriedades de sub diferenciação de certas células subconjuntos22,23,24. Aqui, descrevemos o protocolo de um modelo tridimensional, baseado em esferoide de linhas de células intermediárias e maneiras as células primárias humanas carcinoma de células escamosas como integram e tal modelo em tratamento de câncer de cabeça e pescoço cirurgião e oncologista ( Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Fomos capazes de estabelecer um protocolo para gerar esferoides reprodutíveis de suspensões celulares, para ambas as linhas de célula e, em experimentos preliminares, as células do tumor primário humano. Nós primeiro avaliados dois métodos anteriormente descritos e identificado o ULA-método, um método onde as placas de cultura com ultra baixa aderência são utilizadas, para ser a mais segura e confiável para a geração de esferoides tridimensionais uniformes. Combinando dois métodos distintos para a leitura …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado por uma bolsa da Universidade de Munique (FöFoLe projeto-n. º: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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