Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas
Summary
Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.
Abstract
Opciones actuales de tratamiento para avanzados y recurrente de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) incluyen enfoques de quimio-radiación con o sin cirugía y radiación. Mientras que los regímenes de quimioterapia basados en platino actualmente representan el estándar de oro en cuanto a eficacia y en la mayoría de los casos, nuevos regímenes de quimioterapia, es decir, la inmunoterapia están surgiendo. Sin embargo, las tasas de respuesta y mecanismos de resistencia de la terapia para cualquier régimen de quimioterapia son difíciles de predecir y permanecen insuficientemente entendido. Amplias variaciones de mecanismos de resistencia de radiación y quimio son conocidas hasta la fecha. Este estudio describe el desarrollo de un análisis estandarizado, de alto rendimiento en vitro para evaluar la respuesta de la línea celular HNSCC a varios regímenes de tratamiento y ojalá en células primarias de pacientes individuales como una futura herramienta para tumor personalizada terapia. El ensayo está diseñado para ser integrado en el algoritmo estándar de control de calidad para los pacientes HNSCC en nuestro centro de atención terciaria; sin embargo, esto será tema de futuros estudios. Viabilidad técnica parece prometedora de células primarias de las biopsias tumorales de pacientes reales. Las muestras se transfieren en el laboratorio. Las biopsias se separan mecánicamente seguido por digestión enzimática. Las células son luego cultivadas en ultra baja de la adherencia de la célula los frascos de cultivo que promueven la formación de conglomerados de células tridimensionales en forma de esferoide, reproducible, estandarizada y espontánea. Esferoides son entonces listos para ser expuestos a protocolos de quimio-radiación y protocolos de inmunoterapia según sea necesario. El tamaño de la célula final viabilidad y esferoide son indicadores de susceptibilidad de la terapia y por lo tanto se pueden sacar en cuenta en el futuro para evaluar respuesta a terapia probablemente los pacientes. Este modelo podría ser una herramienta valiosa y rentable hacia una terapia personalizada para el cáncer de cabeza y cuello.
Introduction
Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo con una creciente incidencia de mucosa virus del papiloma humano (VPH) asociada a infección patogenia, junto a una mayoría de casos causada por el alcohol y la nicotina excesiva consumo 1,2. Mientras que tumores más pequeños y las etapas pre-invasivas son generalmente bien tratables con la supresión quirúrgica, generalmente combinada con la disección del nodo de linfa cervical, tratamiento para HNSCC estadio avanzado y recurrente sigue siendo difícil debido a la invasión de tumor agresivo con diseminación metastásica y resistencia a la radiación y la quimioterapia protocolos3,4,5,6,7,8. Estudios recientes sugieren una alta variabilidad del fenotipo celular y sub-caracterización de la circulación y las células del tumor diseminado ha empezado9,10. La creencia anterior de un tumor sólido, uniforme masa tuvo que ser revisada a la luz de estudios recientes en el pasado años11,12,13,14. Enfoques actuales para la caracterización del tumor y la identificación de mutaciones claves podrían identificar varios genes que parecen estar asociados con la resistencia de la terapia, pero siguen un enfoque de coste-intensivo. Por otra parte, el conocimiento del genotipo no permite necesariamente una predicción confiable de fenotipo y su respuesta al tratamiento.
Ha habido pocos avances en mejorar la supervivencia general y libre de enfermedad para la enfermedad de estadio avanzado y recurrente. Para nicotina así como carcinoma asociado a virus, opciones actuales de tratamiento además de cirugía incluyen radiación agresivo y los regímenes de quimioterapia basados en platino. Ha habido implicaciones para las tasas de respuesta diferente entre carcinoma VPH negativos y positivo; sin embargo, esto todavía no conducen a un cambio en general pautas de la terapia. Resistencia a la radiación y la quimioterapia es un fenómeno generalizado en todas las etapas de tumor y existe para quimioterapia con platino, así como para la terapia dirigida (Anti-EGFR; receptor de factor de crecimiento epidérmico) y recientemente de la inhibición de control15. Quimioterapia y radioterapia ineficaces vienen a un costo alto de morbosidad paciente significativa en cuanto a la disfagia, mucositis, boca seca y el riesgo de disminución de la función renal o cardíaca, entre otros. Predecir a antes de la terapia respuesta la decisión de un concepto general de la terapia para cada paciente parece ser el objetivo fundamental, prevenir conceptos innecesarios del tratamiento, efectos secundarios y los costos.
Se buscó establecer un modelo para probar susceptibilidad de tratamiento de cada paciente hacia la actual quimio-radiación estándar que podría integrarse en el algoritmo de tratamiento oncológico regular y control de calidad desde un punto técnico permanente. El lejano objetivo era utilizar el modelo sin usar líneas celulares muy alterada y envejecida, como mal que representan células del tumor humano real sin su variabilidad y heterogeneidad como sabemos ahora, al establecimiento del Protocolo se realizó en varias líneas celulares. Para ser independiente sólo desde líneas celulares disponibles en el mercado, nos recientemente con éxito genera una línea intermedia de la célula llamada “PiCa” de las células primarias de HNSCC de muestras tumorales humanas con marcadores celulares conservados en sus pasajes superficiales y limitadas 16. línea de celular esta PiCa debe servir como una preparación para el desarrollo del modelo en el camino para más adelante siguiendo los ensayos con células de cáncer humanas frescas procedentes de biopsias de tumor. Se ha demostrado que las células en la célula tridimensional las culturas reaccionan de manera diferente y más en vivo-como a la administración de fármacos contra el cáncer que crecen en monocapas17,18,19,20 ,21, debido principalmente a la conservación de migratorias y diferenciación de las propiedades de ciertos subconjuntos de células22,23,24. Aquí, describimos el protocolo de un modelo tridimensional, basado en el esferoide de líneas de células intermedias y formas y células de carcinoma de célula squamous humanos primario Cómo integran este modelo en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello cirujano y oncólogo ( Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos sido capaces de establecer un protocolo para generar esferoides reproducibles a partir de suspensiones celulares, para ambas líneas celulares y, en experimentos preliminares, las células humanas del tumor primario. Primero evaluaron dos métodos anteriormente descritos e identificó el ULA-método, un método donde se utilizan placas con superficies de adherencia muy bajas, para ser la más segura y más confiable para la generación de esferoides tridimensionales uniforme. Mediante la combinación de dos método…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por una beca de la Universidad de Munich (no. FöFoLe proyecto: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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