Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose
Summary
Descriviamo l’evoluzione di un modello tridimensionale, basato su sferoide in vitro che permette di testare l’attuale standard di regimi di terapia sperimentale per testa e collo carcinoma di cellule squamous su linee cellulari, che mira a valutare la terapia suscettibilità e resistenza su cellule primarie dagli esemplari umani in futuro.
Abstract
Opzioni correnti di trattamento per avanzati e ricorrente di testa e collo carcinoma di cellule squamous (HNSCC) racchiudono radiazione e approcci chemio-radioterapia con o senza la chirurgia. Mentre i regimi di chemioterapia platino-basata attualmente rappresentano il gold standard in termini di efficacia e sono indicati nella maggior parte dei casi, i nuovi regimi di chemioterapia, vale a dire l’immunoterapia stanno emergendo. Tuttavia, i tassi di risposta e meccanismi di resistenza di terapia per entrambi il regime chemio sono difficili da prevedere e rimangono insufficientemente capiti. Ampie variazioni dei meccanismi di resistenza di chemio e radiazioni sono noti fino ad oggi. Questo studio descrive lo sviluppo di un test standardizzato, ad alta produttività in vitro per valutare la risposta di linea HNSCC cellulare ai vari regimi di terapia e, auspicabilmente, su cellule primarie da singoli pazienti come un futuro strumento per tumore personalizzato terapia. Il dosaggio è stato progettato per essere integrato nell’algoritmo standard di qualità controllata per pazienti HNSCC presso il nostro centro di cura terziario; Tuttavia, questo sarà oggetto di futuri studi. Fattibilità tecnica sembra essere molto promettente per cellule primarie da biopsie del tumore dai pazienti reali. I campioni sono poi trasferiti in laboratorio. Le biopsie sono separate meccanicamente seguita da digestione enzimatica. Le cellule vengono poi coltivate in flaconi di coltura cellulare ultra-bassa adesione che promuovono la formazione riproducibile, standardizzata e spontanea dei conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Sferoidi sono pronti per essere esposti a protocolli di chemio-radioterapia e protocolli di immunoterapia come necessario. La dimensione di vitalità e sferoide di cella finale sono indicatori di suscettibilità di terapia e di conseguenza potrebbe essere disegnato in considerazione in futuro, per valutare la risposta probabile terapia dei pazienti. Questo modello potrebbe essere uno strumento prezioso, costo-efficiente verso una terapia personalizzata per il cancro del collo e della testa.
Introduction
Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è il sesto più comune cancro in tutto il mondo con un’incidenza aumentante della patogenesi associata a infezione mucosa papillomavirus umano (HPV), accanto a una maggioranza dei casi causati dall’alcol e nicotina eccessiva consumo di 1,2. Mentre più piccoli tumori e fasi pre-invasive sono di solito ben curabile con l’asportazione chirurgica, di solito combinata con la dissezione di linfonodo cervicale, trattamento per stadio avanzato e ricorrenti HNSCC rimane impegnativo a causa dell’invasione del tumore aggressivo con la diffusione metastatica e resistenza alla radiazione e chemioterapia protocolli3,4,5,6,7,8. Gli studi recenti suggeriscono un’alta variabilità del fenotipo cellulare e sub-caratterizzazione di circolazione e le cellule del tumore diffuso è appena iniziata9,10. La precedente convinzione di un tumore solido, uniforme massa ha dovuto essere rivisto alla luce di recenti studi in passato anni11,12,13,14. Approcci attuali per la caratterizzazione del tumore e l’identificazione di mutazioni chiave potrebbero identificare numerosi geni che sembrano essere associati con resistenza di terapia ma rimangono un approccio costo elevato. Inoltre, conoscenza del genotipo non consente necessariamente una previsione affidabile del fenotipo e la sua risposta al trattamento.
Ci sono stati pochi progressi nel miglioramento della sopravvivenza globale e libera da malattia per malattia in stadio avanzato e ricorrente. Per nicotina – così come carcinoma virus-collegato, le opzioni correnti di trattamento oltre ambulatorio racchiudono aggressivo radiazione e chemioterapia platino-basata. Ci sono state conseguenze per i tassi di risposta diversa fra carcinoma HPV-negativi e positivo; Tuttavia, questo non ha ancora portare a un cambiamento in generale le linee guida di terapia. Resistenza nei confronti di radiazione e la chemioterapia è un fenomeno diffuso in tutte le fasi del tumore ed esiste per chemioterapia platino-basata anche per quanto riguarda la terapia mirata (Anti-EGFR; ricevitore di fattore di crescita epidermico) e recentemente emergenti checkpoint inibizione15. Chemioterapia e radioterapia inefficace hanno un costo elevato di morbosità significativa paziente in termini di disfagia, mucosite, secchezza delle fauci e rischio di diminuzione della funzione renale o cardiaca, tra gli altri. Prima risposta di terapia di predizione della decisione di un concetto di terapia generale per ogni singolo paziente sembra essere l’obiettivo cruciale, impedire il trattamento inutile concetti, effetti collaterali e costi.
Abbiamo cercato di stabilire un modello per testare SUSCETTIBILITA trattamento del singolo paziente attuale chemio-radioterapia standard che poteva essere integrata nell’algoritmo di trattamento oncologico regolari e qualità controllata da un punto di tecniche in piedi. L’obiettivo lontano era quello di utilizzare il modello senza utilizzare linee cellulari pesantemente alterato e invecchiato, come scarsamente rappresentano le cellule di tumore umano effettivo senza loro variabilità ed eterogeneità come la conosciamo ora, mentre l’istituzione del protocollo è stato fatto in varie linee cellulari. Per essere indipendente solo da linee cellulari disponibili in commercio, abbiamo generato recentemente con successo una linea di cella intermedio chiamata “PiCa” da cellule primarie di HNSCC da esemplari del tumore umano con markers cellulari conservato il suoi passaggi superficiale e limitate 16. linea cellulare questo PiCa dovrebbe servire come preparazione per lo sviluppo del modello sulla strada per poi successivamente seguendo studi con cellule tumorali umane fresche da biopsie del tumore. È stato dimostrato che cellule nella cellula tridimensionale culture reagiscono in modo diverso e più in vivo-come per la somministrazione di farmaci di cancro rispetto a quelli che crescono in strati monomolecolari17,18,19,20 ,21, principalmente a causa della conservazione dei migratori e proprietà Sub-differenziazione di alcune cellule sottoinsiemi22,23,24. Qui, descriviamo il protocollo di un modello tridimensionale, basato su sferoide da linee cellulari intermedi e modi e cellule di carcinoma di cellule squamous umano primario come integrano tale modello nel trattamento del cancro del collo e della testa chirurgo e oncologo ( Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Siamo stati in grado di stabilire un protocollo per generare sferoidi riproducibile da sospensioni cellulari, per entrambe le linee cellulari e, in esperimenti preliminari, cellule primarie del tumore umano. Abbiamo valutato due metodi precedentemente descritti e identificati l’ULA-metodo, un metodo dove sono utilizzati piatti di coltura con superfici ultra-bassa aderenza, per essere quello più sicuro e affidabile per la generazione di sferoidi tridimensionale uniforme. Combinando i due metodi distinti per lettura di do…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato da un contributo dell’Università di Monaco di Baviera (n. FöFoLe progetto: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
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