Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom
Summary
We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.
Abstract
Huidige behandelingsopties voor geavanceerde en steeds terugkerende hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) omsluiten straling en chemo-straling benaderingen met of zonder chirurgie. Terwijl platinum gebaseerde chemotherapie regimes momenteel vertegenwoordigen de goudstandaard in termen van werkzaamheid en worden gegeven in de overgrote meerderheid van de gevallen, nieuwe chemotherapie regimes, namelijk immunotherapie zijn in opkomst. De berekening van responsrates en therapie resistentie mechanismen voor beide chemo regime zijn echter moeilijk te voorspellen en blijven onvoldoende begrepen. Brede variaties van chemo en straling resistentie-mechanismen zijn bekend tot op heden. Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een gestandaardiseerde, hoge-doorvoer in vitro assay beoordelen HNSCC cellijn reactie op verschillende therapie-regimes, en hopelijk op primaire cellen van individuele patiënten als een toekomstige instrument voor gepersonaliseerde tumor therapie. De bepaling is ontworpen om te worden geïntegreerd in de kwaliteit-gecontroleerde standaard algoritme voor HNSCC patiënten bij onze tertiaire care center; Dit is echter onderwerp van toekomstige studies. Technische haalbaarheid ziet er veelbelovend voor primaire cellen van de tumor Biopten van daadwerkelijke patiënten. Monsters worden vervolgens overgebracht naar het laboratorium. Biopten worden mechanisch gescheiden gevolgd door enzymatische spijsvertering. Cellen worden vervolgens gekweekt in ultra-lage wrijvingscoëfficiënt cel cultuur flesjes ter bevordering van de reproduceerbaar, gestandaardiseerde en spontane vorming van driedimensionale, sferoïde-vormige cel conglomeraten. Spheroïden zijn dan klaar om te worden blootgesteld aan chemo-straling protocollen en immunotherapie protocollen zo nodig. De grootte van de laatste cel levensvatbaarheid en sferoïde zijn indicatoren van therapie gevoeligheid en daarom in de toekomst te beoordelen van de patiënten waarschijnlijk therapie antwoord rekening konden worden getrokken. Dit model zou een waardevolle, kosten-efficiënte hulpmiddel naar gepersonaliseerde therapie voor hoofd en nek kanker.
Introduction
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is de zesde gemeenschappelijkste kanker wereldwijd met een stijgende incidentie voor cutane humaan papillomavirus (HPV) infectie-geassocieerde pathogenese, naast een meerderheid van de gevallen veroorzaakt door buitensporige nicotine en alcohol verbruik 1,2. Terwijl kleinere tumoren en vooraf invasieve stadia meestal goed te behandelen met chirurgische excisie zijn, meestal in combinatie met cervicale lymfeklier dissectie, blijft behandeling voor geavanceerde-fase en terugkerende HNSCC uitdagend als gevolg van agressieve tumor invasie met metastatische verspreiding en weerstand tegen straling en chemotherapie protocollen3,4,5,6,7,8. Recente studies suggereren een hoge variabiliteit van cellulaire fenotype en sub karakterisering van circulerende en gedissemineerde tumorcellen is net begonnen9,10. De eerdere overtuiging van een solide, uniforme tumor massa moest worden herzien in het licht van de recente studies in het verleden jaar11,12,13,14. Huidige benaderingen voor de karakterisering van de tumor en identificatie van belangrijke mutaties kunnen het identificeren van verschillende genen die lijken te worden geassocieerd met therapie resistentie maar blijven een kosten-intensieve aanpak. Bovendien kennis met genotype niet noodzakelijkerwijs toe dat een betrouwbare voorspelling van fenotype en de reactie van de behandeling.
Er zijn weinig vorderingen bij het verbeteren van de algehele en ziektevrije overleving voor geavanceerde-fase en terugkerende ziekte. Nicotine – evenals virus-geassocieerde carcinoom, huidige behandelingsopties naast chirurgie plaatst u agressieve straling en chemotherapie platina gebaseerde regimes. Zijn er gevolgen voor verschillende respons tussen HPV-negatieve en positieve carcinoom; echter dit is nog niet leiden tot een wijziging in het algemeen therapie richtlijnen. Weerstand naar de bestraling en chemotherapie is een wijdverspreid fenomeen in alle stadia van de tumor en bestaat voor platina gebaseerde chemotherapie alsook voor gerichte therapie (Anti-EGFR; epidermale groeifactor-receptor) en onlangs opkomende checkpoint remming15. Ineffectief bestraling en chemotherapie komt op een hoge kosten van significante patiënt morbiditeit in termen van dysfagie, mucositis, droge mond en risico daling van renale of cardiale functie onder anderen. Voorspellen van therapie antwoord vóór lijkt het besluit van een algemene therapie-concept voor elke individuele patiënt het cruciale doel, het voorkomen van geen onnodige behandeling concepten, de bijwerkingen en de kosten.
Wij willen een model om te testen van de individuele patiënt behandeling gevoeligheid naar huidige standaard chemo-straling die kan worden geïntegreerd in het algoritme van de regelmatige en kwaliteit-gecontroleerde oncologische behandeling van een technische staande punt vestigen. De verre doel was om het gebruik van het model zonder het gebruik van sterk veranderde en leeftijd cellijnen, als ze slecht werkelijke menselijke tumorcellen zonder hun variabiliteit vertegenwoordigen en heterogeniteit zoals we nu, terwijl de vaststelling van het protocol weten werd gedaan in verschillende cellijnen. Om onafhankelijk te zijn alleen van commercieel beschikbare cellijnen, wij onlangs met succes gegenereerd een tussenliggende cellijn genaamd “PiCa” uit primaire HNSCC cellen van menselijke tumor exemplaren met geconserveerde cellulaire markeringen op het oppervlak en beperkte passages 16. deze PiCa cellijn dient als voorbereiding op de ontwikkeling van het model op de weg om vervolgens te proeven met verse menselijke kankercellen van tumor biopsieën later volgen. Het is aangetoond dat cellen in drie-dimensionale cel culturen anders reageren en meer in-vivo-beheer van kanker medicijnen dan die groeien in monolayers17,18,19,20 willen ,21, voornamelijk te wijten aan de instandhouding van migrerende en sub differentiatie eigenschappen van bepaalde cel subsets22,23,24. Hier beschrijven we het protocol van een sferoïde gebaseerde, driedimensionaal model van tussenliggende cellijnen en primaire menselijke plaveiselcelcarcinoom cellen en manieren hoe een dergelijk model in de behandeling van kanker van het hoofd en de nek chirurg en oncoloog ( integreren Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
We waren in staat om een protocol voor het genereren van reproduceerbaar spheroïden van cel schorsingen, voor beide cellijnen, en voorbereidende experimenten, primaire tumor van de menselijke cellen. We eerst beoordeeld van de twee eerder beschreven methoden en de ULA-methode, een methode waar cultuur platen met ultra-lage wrijvingscoëfficiënt oppervlakken worden gebruikt, zijn de veiliger en betrouwbaarder voor de generatie van uniforme driedimensionale spheroïden geïdentificeerd. Door het combineren van twee apart…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door een subsidie van de Universiteit van München (FöFoLe project-nr.: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters’ significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies?. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
