Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi
Summary
Terapi değerlendirilmesi amaçlayan deneysel tedavi rejimleri hücre hatları, baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için geçerli standart test etmemizi sağlayan bir küresel tabanlı, üç boyutlu vitro modeli evrimi tarif duyarlılık ve direnci Primer hücre insan örnekler üzerinden üzerinde içinde belgili tanımlık gelecek.
Abstract
Güncel tedavi seçenekleri için gelişmiş ve tekrarlayan baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) radyasyon ve kemoterapi-radyasyon yaklaşımlar ile veya ameliyat olmadan alın. Platin tabanlı kemoterapi rejimleri şu anda altın standart etkinliği açısından temsil ve durumlarda, yeni kemoterapi rejimleri, büyük çoğunluğu verilir Yani immünoterapi gelişmekte olan. Ancak, yanıt oranları ve terapi direnç mekanizmaları ya kemoterapi rejimi için tahmin ve yeterince anlaşılır olmaya devam etmek zordur. Kemoterapi ve radyasyon direnç mekanizmaları geniş varyasyonlar Tarih olarak bilinir. Bu çalışmada kişiselleştirilmiş tümör için gelecek bir araç olarak bireysel hastalardan HNSCC hücre kültürünü’nın yanıt çeşitli tedavi rejimleri ve umut verici bir biçimde Primer hücre değerlendirmek için bir standart, yüksek üretilen iş vitro tahlil gelişimi anlatılmaktadır terapi. Tahlil kalite kontrollü standart algoritma Tersiyer bakım merkezimizde HNSCC hastalar için varlık bütünleşmek için tasarlanmıştır; Ancak, bu gelecekteki çalışmaların konusu olacaktır. Teknik fizibilite tümör biyopsi gerçek hastalarda Primer hücre için umut verici görünüyor. Örnek sonra laboratuvar aktarılır. Biyopsi mekanik olarak Enzimatik sindirim ardından ayrılır. Hücreleri sonra üç boyutlu, küresel şeklinde hücre ikinci büyük şirketler tekrarlanabilir, standart ve spontan oluşumu teşvik Ultra düşük yapışma hücre kültür şişeleri kültürlü. Pulcuklarının sonra kemoterapi-radyasyon protokolleri ve gerektiğinde immünoterapi protokolleri maruz hazırız. Son hücre canlılığı ve küresel boyutu terapi duyarlılık göstergeleri vardır ve bu nedenle gelecekte hastaların muhtemel tedavi yanıtı değerlendirmek için dikkate çekilmiş olabilir. Bu model baş ve boyun kanseri için kişiselleştirilmiş terapi doğru değerli, maliyet-etkin bir araç olabilir.
Introduction
Baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) Mukozal insan Papilloma Virus (HPV) enfeksiyon ilişkili Patogenez, çoğu durumda aşırı nikotin ve alkol neden yanında yükselen insidansı ile dünya çapında altıncı en yaygın kanser olduğunu tüketimi 1,2. Daha küçük tümörler ve önceden invazif aşamalarında genellikle de genellikle servikal lenf nodu diseksiyonu ile kombine cerrahi eksizyon ile tedavi edilebilir olmakla birlikte gelişmiş aşama ve tekrarlayan HNSCC için tedavi ile agresif tümör işgali nedeniyle zorlu kalır metastatik yaymak ve direnç radyasyon ve kemoterapi protokolleri3,4,5,6,7,8. Son yıllarda yapılan çalışmalarda hücresel fenotip yüksek bir değişkenliği ve dolaşan alt karakterizasyonu önermek ve Dissemine tümör hücreleri sadece9,10başladı. Önceki inancı sağlam, tek tip tümör kitle vardı geçmişte son çalışmalar ışığında gözden geçirilmesi yıl11,12,13,14. Tümör karakterizasyonu ve anahtar mutasyonlar tanımlaması için geçerli yaklaşımlar tedavi direnci ile ilişkili ancak maliyet-yoğun yaklaşım kalır gibi görünüyor birkaç genler teşhis edebilir. Ayrıca, genotip bilgisine mutlaka fenotip ve onun tedaviye yanıt güvenilir bir tahmin izin vermez.
Gelişmiş aşama ve tekrarlayan hastalığı için genel ve hastalıksız sağkalım iyileştirilmesinde birkaç gelişmeler oldu. Nikotin – yanı sıra için virüs ilişkili Karsinomu, mevcut tedavi seçenekleri yanı sıra ameliyat agresif radyasyona ve platin tabanlı kemoterapi rejimleri alın. HPV-negatif ve pozitif Karsinomu arasında farklı yanıt oranları için etkileri olmuştur; Ancak, bu değil henüz bir değişiklik için genel olarak tedavi yönergeleri kurşun. Radyasyon ve kemoterapi direnci tüm tümör aşamalarında yaygın bir olgudur ve platin tabanlı kemoterapi de hedefe yönelik tedavi (Anti-EGFR; gelince için var epidermal büyüme faktörü reseptörü) ve son denetim noktası inhibisyon15gelişmekte olan. Etkisiz radyasyon ve kemoterapi disfaji, Mukozit, ağız kuruluğu ve diğerleri arasında böbrek veya kalp fonksiyonu azalma riski açısından önemli hasta morbidite yüksek bir maliyetle geliyor. Terapi yanıt önceden tahmin genel tedavi kavramı karar bireysel her hasta için gereksiz tedavi kavramları, yan etkileri ve maliyeti engelleyen çok önemli hedefi olacak gibi görünüyor.
Bireysel hastanın tedavi duyarlılık geçerli standart kemoterapi-düzenli ve kalite kontrollü Onkolojik tedavi algoritması teknik ayakta noktadan içine entegre olabilir radyasyon karşı test etmek için bir model kurmak istedi. Onlar kötü onların değişkenlik olmadan gerçek insan tümör hücreleri temsil ve protokol kurulması sırasında bildiğimiz gibi heterojen çeşitli hücre hatlarında yapıldı gibi ağır değiştirilmiş ve yaşlı hücre hatları, kullanmadan modeli kullanmak için uzak hedef oldu. Yalnızca ticari olarak kullanılabilir hücre satırlarından bağımsız olmak, biz son zamanlarda başarıyla “PiCa” adı verilen bir ara cep çizgi insan tümör numuneler birincil HNSCC hücrelerden onun yüzey ve sınırlı geçişleri korunmuş hücresel imleçli kaynaklandığı 16. bu pika hücre kültürünü görülmesi gerektiğini yolda modeli geliştirilmesi için bir hazırlık olarak sonra sonra denemeler ile taze insan kanser hücrelerinin tümör biyopsi aşağıdaki için. Bu hücreleri üç boyutlu hücre kültürleri tepki farklı ve daha fazla vivo içindegösterilmiştir-yönetim–dan o monolayers17,18,19‘,20 büyüyen kanser ilaçların ister ,21, özellikle göçmen korunması nedeniyle ve alt farklılaşma özellikleri belirli hücre alt kümeleri22,23,24. Burada, biz küresel tabanlı, üç boyutlu model ara hücre satırlarından Protokolü tanımlamak ve birincil insan Skuamöz Hücre Karsinomu hücre ve yolları nasıl böyle bir model baş ve boyun cerrah ve Onkoloji ( kanser tedavisinde entegre Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz tekrarlanabilir pulcuklarının hücre süspansiyonlar, her iki hücre hatları için ve ön deneylerde, birincil insan tümör hücreleri oluşturmak için bir protokol kurmayı başardık. İlk iki önceden açıklanan yöntemleri değerlendirildi ve ULA-yöntem, ultra düşük yapışma yüzeyler ile Kültür plakalar, üniforma üç boyutlu pulcuklarının nesil için daha güvenli ve daha güvenilir biri olarak kullanıldığı bir yöntem tanımlanır. Tahlil okuma (boyutu/alan ve hücre canlılığı) için ik…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Münih Üniversitesi bir grant tarafından finanse edildi (FöFoLe Proje-No: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters’ significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies?. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
