Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture
Summary
Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l’interfaccia liquido-aria.
Abstract
Histocultures permettono di studiare le interazioni intercellulari all’interno dei tessuti umani, e possono essere impiegati per interazioni ospite-patogeno modello in condizioni di laboratorio controllate. Ex vivo l’infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV), tra altri virus, è stato utilizzato con successo per studiare la patogenesi della malattia precoce, così come una piattaforma per testare l’efficacia e la tossicità dei farmaci antivirali. Nel presente protocollo, spieghiamo come elaborare e infettare con HIV-1 espianti di tessuto umane tonsille e mucose cervicali e mantenute in coltura in cima spugne di gelatina all’interfaccia liquido-aria per circa due settimane. Questa impostazione non polarizzato cultura massimizza accesso alle sostanze nutrienti nel terreno di coltura e di ossigeno, anche se la perdita progressiva di architetture funzionali e l’integrità del tessuto rimane il suo limite principale. Questo metodo consente il monitoraggio replica di HIV-1 e patogenesi utilizzando diverse tecniche, tra cui test immunologici, qPCR e citometria a flusso. Di importanza, la variabilità fisiologica tra donatori di tessuti, nonché tra espianti provenienti da diverse aree del campione stesso, può incidere significativamente i risultati sperimentali. Per garantire la riproducibilità dei risultati, è fondamentale utilizzare un adeguato numero di espianti, replicati tecnici e controllo di donatore-pari condizioni per normalizzare i risultati dei trattamenti sperimentali durante la compilazione di dati provenienti da esperimenti multipli (cioè ., condotto utilizzando tessuti da donatori diversi) per l’analisi statistica.
Introduction
Colture cellulari di bi-dimensionale monotipico, cui qui come convenzionale, non tengono conto la comunicazione spaziale e funzionale tra la grande varietà di tipi di cellule che compongono i tessuti e organi. Questo aspetto è di fondamentale importanza per modelli sperimentali della malattia, come interferenze con interazioni intercellulari omeostatici sono il fattore trainante di tutte le patologie. Espianti di tessuto offrono importanti vantaggi per la modellazione di salute e malattia in esseri umani perché mantengono la citoarchitettura e molti importanti aspetti funzionali degli organi come sono in vivo, anche se per un periodo limitato di tempo1. Ad esempio, all’ex vivo sfida con antigeni di richiamo, come il tossoide difterico o tossoide tetanico, tessuto tonsillar risponde con una vigorosa produzione di anticorpi specifici per l’antigene2. Come qualsiasi altro ex vivo modello, histoculture ha le proprie limitazioni: variabilità inter-donatore, polarizzazione di tessuto, sopravvivenza limitata del tessuto e la difficoltà nel monitoraggio celle oltre la profondità di microscopia confocale1. Espianti di tessuto umano rimangono comunque, un modello di scelta per lo studio dei processi immunologici omeostatici e patogeni in esseri umani, tra cui interazioni ospite-patogeno e potenziali interventi terapeutici3.
Gli eventi critici della patogenesi di HIV-1 si svolgono nei tessuti. Infezione della mucosa genitale rappresenta la maggior parte di tutti gli eventi trasmissione HIV-1 in tutto il mondo4. Tessuto linfoide è il sito principale di replicazione del virus durante l’infezione acuta e porti un significativo pool di cellule latente infettate5, e la loro persistenza rappresenta il principale ostacolo per ottenere una cura6. La sfida di cultura ed ex vivo dei tessuti mucosi e linfoidi umani forniscono alcuni vantaggi rispetto ai sistemi convenzionali basati su cellule isolate per lo studio del virus HIV-1. Per esempio, le cellule tessuto-residente possono supportare l’infezione HIV-1 in assenza di attivazione esogena, al contrario di cellule mononucleari di anima periferica1. L’utilizzo di espianti di tessuto linfoide ha permesso una migliore comprensione di alcuni meccanismi chiave alla base CD4 T cell lo svuotamentocioè, l’ effetto bystander7, che è il segno dell’infezione acuta. Il mantenimento delle strutture come follicoli di cellule B del tessuto linfoide8 e l’epitelio in espianti di mucosa genitale femminile9 offre l’opportunità unica di integrare funzionalità spaziale e funzionale dell’infezione da HIV-1 in questi siti. Infine, histocultures sono stati usati con successo per modello e studio co-infezione da HIV-1 e herpesvirus10,11, così come per i test preclinici di antiretrovirali e multitarget microbicidi12, 13 , 14 , 15.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la cultura degli espianti di tessuto umano ottenuto da tonsille e tessuto mucoso dal tratto genitale femminile più basso (cervice), che copre la dissezione del tessuto per explant sfida con HIV-1 in un modo non polarizzato. La cultura degli espianti di tessuto all’interfaccia liquido-aria, utilizzando spugne di gelatina come supporto, massimizza l’esposizione ad aria ossigeno garantendo accesso alle sostanze nutrienti del terreno di coltura attraverso la spugna capillari, ritardando così il loro decadimento naturale. Il modo più immediato di valutazione replica di HIV-1 nel nostro sistema è quello di misurare la quantità di virus rilasciati nel terreno di coltura explant nel tempo di dosaggio immunologico o qPCR. Infezione da HIV-1 e la patogenesi (ad es., deplezione delle cellule T CD4 +) possono anche essere valutati in espianti di tessuto dalla mole estrazione di RNA/DNA e qPCR, in situ macchiatura o singola cellula-analisi sulla digestione del tessuto tramite flusso cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di tessuti umani espianti per lo studio dell’infezione da HIV-1 fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi sperimentali bi-dimensionale e l’unica specie, quali cellule primarie o linee cellulari, grazie alla loro capacità superiore di riprodurre interazioni intercellulari e cellulare (per esempio, la produzione di citochine) funzioni così come sono nel vivo. Tuttavia, tessuto tonsillar e cervicale differiscono per molti aspetti, tra cui il numero e le caratteristiche fenotipiche e funzio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della Fondazione Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), i medici svedesi di Fondazione contro l’AIDS (http://www.aidsfond.se/, Rif. FOa2014-0006) e Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
