Summary
在该协议中, 杆状病毒是通过瞬态转染杆状病毒质粒进入 Sf9 细胞并在无血清悬浮培养中扩增而产生的。用肝素亲和层析法纯化上清液, 进一步浓缩离心。该协议对用于基因治疗的杆状病毒的制备和纯化具有重要意义。
Abstract
杆状病毒传统上被用于生产重组蛋白和疫苗。然而, 最近, 杆状病毒正逐渐成为基因治疗应用的一个有希望的载体。在这里, 杆状病毒是由 Sf9 细胞黏附培养的杆状病毒质粒 DNA (bacmid) 的瞬态转染而产生的。杆状病毒随后在无血清悬浮培养的 Sf9 细胞中展开, 直到获得所需的体积。然后用肝素亲和层析法从培养上清液中纯化。由于肝素对杆状病毒包络糖蛋白的亲和性, 在上清液中将杆状病毒颗粒结合在一起的肝素柱上上清。该列用缓冲区冲洗, 以去除污染物, 而杆状病毒则是用高盐缓冲柱洗脱的。洗脱液被稀释为一个等渗盐浓度, 杆状病毒粒子进一步集中使用离心。使用这种方法, 杆状病毒可以集中到500倍, 25% 的传染性微粒的恢复。虽然这里描述的协议表明了从培养到1升的杆状病毒的生产和纯化, 该方法可以扩大在封闭系统悬浮培养, 以产生一个临床级的载体, 用于基因治疗的应用。
Introduction
杆状病毒主要用于生产重组蛋白和疫苗的鳞翅目斜纹 fugiperda (Sf) 9 昆虫细胞使用重组杆状使用杆状 multicapsid 核多角体病毒 (AcMNPV)1,2,3,4. 最近, 它正在成为基因治疗应用5的一个有希望的载体。众所周知, 它具有广泛的宿主和组织取向, 感染静止和增殖细胞, 是非致病性的, 并没有集成到主机染色体4,5,6。此外, 杆状病毒可以在无血清悬浮培养, 可伸缩性, 并允许为未来的临床生产关闭系统处理1。
杆状病毒粒子的纯度对于实现有效的转导非常重要, 同时尽量减少细胞毒性7,8,9。杆状病毒可以通过离心或切向流动过滤 (TFF) 来集中, 对其传染性有有限的影响。然而, 这些程序不仅集中了病毒微粒, 而且还有来自 Sf9 文化的细胞碎片和蛋白质, 这可能是有毒的体外(个人观察), 在使用体内时可能诱发炎症或免疫应答。为了避免这种情况, 特别是在使用高度集中的病毒储存时, 感染性杆状病菌需要纯化, 并与污染微粒分离。
报告了几种用于纯化和浓缩杆状病毒载体的方法10,11,12。在现有的方法中, 肝素亲和色谱允许单步高水平的纯化与低浓度的污染蛋白12。该方法是基于硫酸硫酸根的识别作为杆状病毒13,14的受体。在将 Sf9 细胞上移到杆状病毒的柱上并结合后, 该柱可以用生理 (等渗) 缓冲器冲洗, 以去除未绑定或松散的污染微粒。由于对肝素的结合是可逆的, 杆状病毒颗粒可以洗脱高盐缓冲, 这是立即稀释到生理 (等渗) 盐浓度, 以防止通过渗透冲击 12.此外, 杆状病毒的生产, 以及从色谱柱上捕获和洗脱, 可以使用一个封闭系统的过程, 这是符合当前良好的生产实践 (cGMP)。
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 以制造, 纯化和浓缩的传染性杆状病毒使用亲和层析和离心。简要地, 我们生产杆状病毒通过转染 Sf9 细胞与杆状病毒质粒 DNA 在黏附培养和进一步扩大传染性杆状病毒在无血清悬浮培养。我们用肝素亲和层析纯化杆状病毒, 并以离心为最后一步, 高度集中载体进行基因治疗应用。
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Protocol
有关汇总协议的说明, 请参见图 1 。
1. 杆状病毒质粒 DNA 的纯化
- 用抗生素在200毫升的 LB 汤中生长含有杆状病毒质粒 DNA (bacmid) 14 的细菌培养;卡那霉素 (50 µg/毫升), 四环素 (10 µg/毫升), 和庆大霉素 (7 µg/毫升), 16 h 在37°c 在一个轨道振动筛设置在 300 rpm。
- 使用标准碱性裂解协议15从细菌培养中纯化 bacmid DNA, 并将 bacmid 溶解在 TE 缓冲器中。
2. 杆状病毒的生产
- 培养 Sf9 细胞的轨道振动筛孵化器在 135 rpm 和28°c 的聚碳酸酯锥形瓶含有无血清昆虫培养介质1,2,3。
注意:如果 Sf9 细胞从冷冻的库存解冻, 允许至少两个星期的细胞恢复和进入指数阶段的增长。 - 用台盼蓝染色 hemocytometer, 计数在生长指数阶段 Sf9 细胞。种子 1 x 106可行的 Sf9 细胞每井在6井组织培养处理的板材在2毫升培养基中。允许单元格在孵化器中的28摄氏度处附加1小时。
- 用1毫升无血清 unsupplemented 的昆虫培养基取代生长培养基。
- 利用昆虫细胞转染试剂将 bacmid DNA 染到 Sf9 细胞中。
- 将8µL 昆虫细胞转染试剂与100µL 的宽限期昆虫培养基混合使用。
- 将2µg 的 bacmid DNA 稀释成 unsupplemented 昆虫培养基的100µL, 并通过涡流轻轻混合。
- 将稀释后的 DNA 与稀释后的昆虫细胞转染试剂结合, 轻轻混合。室温下孵育15至30分钟。
- 将 DNA 脂质混合物滴在细胞上。孵化在28°c 在一个孵化器大约5小时。
- 从细胞中取出转染的混合物, 用2毫升的 PBS 冲洗细胞。
- 添加2毫升的昆虫培养基, 并继续培养在28摄氏度的孵化器, 而不改变媒体。
注意:如果 bacmid 含有荧光蛋白, 其表达可以在48小时后转染细胞中检测到。杆状病毒由转染的 Sf9 细胞产生, 并分泌到随后感染 untransfected 细胞的培养基中。整个细胞群在5天内就会感染杆状病毒, 并显示病毒感染的迹象, 也称为病变效应。细胞培养中包括细胞直径的增加, 胞浆中的空泡/颗粒, 细胞生长的停止和死或裂解细胞的存在。然而, 如果转染或感染的效率不是最佳, 文化可能不会显示明显的病变效果。病变效应可以用 200-400X 放大的倒置相显微镜进行可视化。用 anti-gp64 抗体11染色可检测杆状病毒感染细胞。 - 在转染和标签为 P1病毒储存后5天收获杆状病毒上清。
- 储存的杆状病毒上清, 这是轻敏感, 在黑暗中与0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 PBS。贮存在4°c 为短期 (最多90天) 或在-80 摄氏度长期。
- 种子 6 x 106 Sf9 细胞在 10 cm 组织培养处理的板材在10毫升昆虫培养基。将1毫升的最初杆状病毒上清 (P1) 添加到细胞中。
- 收获杆状病毒上清 (P2) 在 5th天后感染。
- 种子50毫升的 Sf9 细胞 (3 x 106细胞/毫升) 的悬浮培养在一个250毫升聚碳酸酯锥形瓶, 并把瓶子在一个轨道振动筛孵化器。将2毫升的 P2库存添加到单元格中, 并在 135 rpm 处晃动, 同时保持28°c 的恒定温度。
注意:感染后三或四天, 整个 Sf9 细胞将显示病变效应, 这是高效杆状病毒产生的征兆。 - 依次放大杆状病毒上清液直到获得所需的体积 (p3,p4,...) 通过增加10到50倍的细胞培养量在随后的每一次感染。
注意:p3是 3rd一轮感染, 其中500毫升至 1 L 的 Sf9 细胞培养可感染10至20毫升 P2杆状病毒上清;p4是 4th的一轮感染, 其中5至 10 L 的 Sf9 细胞培养可感染100至200毫升 P3杆状病毒上清, 等等。通常, 在无血清昆虫培养基中, Sf9 细胞的种子为 3 x 106细胞/毫升。 - 离心的杆状病毒上清 1000 x g 30 分钟在4°c 去除细胞碎片和治疗杆状病毒上清与50单位/毫升核酸酶 (250 单位/µL 股票) 2 摄氏度, 以消化基因组 DNA 和 RNA。通过0.45 微米的过滤单元过滤上清液。
3. 色谱系统的制备
- 用无菌水、1氮氢氧化钠、水和洗涤缓冲器 (20 毫米磷酸钠缓冲液, 含150毫米氯化钠, pH 7.0), 以50毫升/分钟的线性流速, 依次冲洗样品和缓冲线, 制备色谱系统。
- 准备一个肝素50µm 柱 (10 x 10 厘米, 7.9 毫升的柱容积 (CV)) 按顺序运行的柱清洁缓冲 (5 cv 无菌20毫米磷酸钠缓冲液含2米氯化钠, pH 7.0) 和 5 CV 洗涤缓冲器在线性流量的7毫升/分钟。
4. 杆状病毒载体的纯化
- 建立色谱系统如下:
- 使用样品装货入口口岸装载杆状病毒上清。
- 使用缓冲入口端口 A1 加载洗涤缓冲器。准备一瓶至少500毫升的洗涤缓冲器, 并将洗涤缓冲线放进瓶子里。
- 使用缓冲入口端口 A2, 用于装载洗脱缓冲器 (20 毫米磷酸钠, 1.5 米氯化钠, pH 值 8.0)。准备一瓶至少500毫升洗脱缓冲器, 并将洗脱缓冲线放进瓶子里。
- 将50毫升锥形管插入到分数收集器中, 收集柱通过杆状病毒上清, 洗涤缓冲器和洗脱杆状病毒。
- 平衡五7.9 毫升的洗涤缓冲器 (40 毫升) 的肝素柱, 其线性流速为7.0 毫升/分。
- 用色谱系统的采样泵 (进样口) 将250毫升的杆状病毒上清液载入肝素柱上, 其线性流速为2.0 毫升/分。
- 运行 10 CVs (80 毫升) 的洗涤缓冲通过肝素柱在线性流量2.0 毫升/分钟, 直到紫外线 (紫外线) 吸收曲线 (280 nm) 已经返回到基线, 并变得稳定。
- 洗脱7.9 毫升肝素柱上的杆状病毒粒子, 其 5 CVs (40 毫升) 的洗脱缓冲器的线性流速为4.0 毫升/分. 观察当杆状病毒粒子与肝素柱分离时, 色谱中蛋白质的尖锐洗脱峰。
- 洗脱后, 立即稀释洗脱杆状病毒上清10倍, 使用20毫米磷酸钠缓冲液, 以防止在随后的离心过程中, 杆状病毒颗粒从渗透冲击中失活。
- 存储100µL 的每个分数, 包括列流-通过收集在加载的杆状病毒上清, 洗涤缓冲区, 和洗脱液。感染这些杆状病毒分数 HT1080, 以评估纯化过程 (见第 6)。
- 用列清理缓冲区和洗涤缓冲区清理列。最后, 用 5 CV 无菌20% 乙醇在水中以7.0 毫升/分钟的线性流速冲洗柱, 并贮存在4摄氏度。
- 用水、1氢氧化钠、再用水和20% 乙醇在水中以50.0 毫升/分钟的线性流速清洗色谱系统, 并将系统储存在20% 乙醇中。
5. 杆状病毒的浓度
- 使用高压釜预杀菌离心管。添加一个相同数量的杆状病毒上清到每个 ultracentrifuge 管在组织培养罩。通过平衡测量管的重量, 并调整 ultracentrifuge 管的含量与无菌 PBS 的重量。
- 将每个 ultracentrifuge 管放置在 SW 32 钛转子的对立桶中。
- 在4摄氏度时, 以 8万 x g 运行 ultracentrifuge 90 分钟.
- 在组织培养罩中打开 ultracentrifuge 管, 灌装在不去除杆状病毒颗粒的情况下吸入液体。
- 并用重悬吹打的200µL PBS, 用 0.5% (w/卷) BSA, 通过有力地将每根管子的颗粒向上和向下。
- 将浓缩的杆状病毒转移到 cryovials (每瓶50到100µL), 并存储在-80 摄氏度。
6. 杆状病毒滴定法
- 感染前的前一天, 用台盼蓝染色细胞后使用 hemocytometer 计数 HT1080 细胞。种子 1 x 105 HT1080 细胞每井在6井板中的2毫升的 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 含有10% 胎牛血清 (血清)。种子几个额外的水井能够确定在感染时存在的细胞的确切数量。在孵化器的37°c 和 5% CO2中培养细胞。
注意:HT1080 细胞用于滴定, 因为它们表达较高水平的硫酸硫酸与其他细胞线16。由于 HT1080 细胞是黏附的, 滴定比使用传统的 Sf9-based 滴定更简单, 更少的时间消耗。 - 在感染日, 通过对水井中的细胞计数, 确定每个井的细胞数。通过添加稀释后的原杆状病毒, 在柱纯化之前被搁置, 并通过从柱的流动, 洗涤和洗脱分数的样本来感染细胞。对每个样品, 根据传染性杆状病毒粒子的经验, 确定稀释量和体积, 并对每一个井进行三种感染。
- 感染后两天后, 分析细胞对基因表达的兴趣。如果细胞表达荧光蛋白 (例如GFP)17, 则可以使用流式分析仪进行分析。
- 根据在感染时存在的细胞数、稀释因子和细胞中荧光蛋白的百分比, 计算出的滴度 (每毫升感染单位): (感染期间细胞数 x 荧光蛋白的百分比阳性细胞 x 稀释因子)/杆状病毒的体积。
注意:例如, 如果感染时每井细胞总数为 1.2 x 105, 荧光蛋白的百分比为 5%, 稀释因子为 100, 稀释杆状病毒的体积增加10µL, 效价为 6 x 107传染性单位 (IU)。毫升.
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Representative Results
所提供的协议在流程图中 (图 1)。步骤包括对 bacmid DNA 的 Sf9 细胞进行瞬态转染, 在板的黏附培养中产生杆状病毒, 随后在无血清悬浮培养中扩增, 核酸酶处理和离心和过滤澄清,用肝素亲和色谱法纯化后, 离心浓度。
解冻后, Sf9 细胞需要至少两个星期的时间来恢复和进入指数阶段的增长。积极生长的 Sf9 细胞在黏附培养中与 bacmid DNA 转染。转染两天后, 杆状病毒包络糖蛋白的表达, gp64 检测, 随后, 杆状病毒的生产启动11。由于杆状病毒是复制能力, 感染细胞的数量逐渐增加, 因为细胞的渐进感染与新产生的杆状病毒分泌到生长培养基中。含有细胞上清液的杆状病毒在整个细胞群被感染后5天内被采集。此初始病毒上清被指定为通道 1 (P1) 库存。P1股票用于后续感染的新种子黏附培养的 Sf9 细胞在一个较大的板块。整个细胞群在5天内显示感染的迹象, 称为病变效应 (图 2)。第二个附着细胞培养的上清, 被指定为 P2股票。杆状病毒上清在 Sf9 悬浮培养中进一步扩增, 通过持续感染新添加的 Sf9 细胞在一个摇瓶与无血清昆虫细胞培养培养基。在每个感染周期结束时, 大多数细胞显示病变的作用, 细胞直径增加, 死亡或裂解细胞, 这是完成杆状病毒感染的标志。杆状病毒股票按顺序放大, 直到获得所需的体积 (p3, p4,...)。用低速离心法从 Sf9 细胞中分离出清液, 用核酸酶来降低粘度, 通过0.45 微米膜过滤, 然后在随后的纯化和浓缩步骤中使用。
为了纯化杆状病毒, 从感染的 Sf9 细胞上清液加载到肝素柱上。肝素柱逐渐饱和, 强束缚的杆状病毒和松散的蛋白质污染物。在紫外线 (UV) 吸收曲线 (280 nm) 返回基线并变得稳定时, 用洗涤缓冲器冲洗出肝素柱以去除污染物, 表明从柱体中去除未绑定和松散束缚的材料。另一方面, 杆状病毒颗粒与肝素柱紧密结合。因此, 在列洗涤缓冲区中检测不到大量病毒。肝素结合的杆状病毒颗粒与1.5 米氯化钠在 pH 值8.0 洗脱, 稀释10倍与缓冲, 以达到 isotonicity 和防止病毒灭活。在洗脱过程中观察到蛋白质的尖峰, 对应于杆状病毒分数 (图 3)。该色谱协议中使用的试样加载、洗涤和洗脱条件的优化, 可获得纯化的传染性杆状病毒粒子50% 以上的回收率。稀释的上清液进一步集中到500倍与离心和公式化在 PBS 包含 0.5% BSA, 导致净 25%恢复11。
图 1.杆状病毒的生产和纯化原理图Sf9 细胞被播种在细胞培养处理的板块, 转染 bacmid DNA。杆状病毒上清的收获, 并用于感染新的 Sf9 细胞的黏附文化。感染细胞随后在无血清悬浮培养中传播。用核酸酶、离心和过滤处理杆状病毒上清液。杆状病毒经肝素亲和柱层析纯化, 缓冲液稀释, 离心浓缩灌装。最后, 杆状病毒上清液储存在摄氏-80 摄氏度。(该图已从 Nasimuzzaman et., 2016, 摩尔的方法杂志开发. 2016; 3: 16071 与允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.病变病毒感染 Sf9 细胞的作用.用杆状病毒上清法对组织培养的 Sf9 细胞进行了感染。感染后五天, 细胞被可视化为倒置相显微镜。A)未感染的 Sf9 单元格作为控件。B)杆状病毒感染的 Sf9 细胞显示病变效果。单元格以200X 的放大倍数显示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.肝素亲和层析中感染性杆状病毒的数量.HT1080 细胞感染对杆状病毒的效价进行了估计。测试的样品包括列的贯穿, 洗涤和洗脱液。样品根据需要稀释了。线 (暗金刚石) 显示每分数中的杆状病毒的总传染性单位 (IU)。各管柱流经样品和洗涤缓冲器的分数大小为40毫升, 每管洗脱液10毫升。(该图已从 Nasimuzzaman et., 2016, 摩尔的方法杂志开发. 2016; 3: 16071 与允许。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文介绍了在悬浮培养中 Sf9 细胞中杆状病毒的产生和用肝素亲和层析纯化杆状病毒的方法。该协议中使用的参数最大限度地提高了感染杆状病毒的产量, 最大限度地减少了其灭活。此处提供的协议显示, 与其他9实现的恢复相比, 杆状病毒粒子的恢复明显改善。
由于广泛的寄主范围和组织取向, 在中枢神经系统、肝、眼、卵巢、前列腺和睾丸中进行了多项研究, 以杆状病毒介导的基因传递5,6,7,8.包含治疗基因的杆状病毒载体, 如自杀基因、抑癌基因和编码肿瘤特异抗原的基因, 已成功地在临床前动物模型18,19上进行。虽然杆状病毒能传感器人类细胞, 但它只能传播到昆虫细胞中, 因此不会对人类的受者造成危险。
bacmid DNA 的瞬态转染是昆虫细胞产生的杆状病毒。bacmid 的质量对高效杆状病毒的生产至关重要。通常, 刚准备好的 bacmid 比那些在冰箱里储存很长时间的性能要好。积极生长的 Sf9 细胞能有效地转染, 产生高效的杆状病毒。在扩增阶段, 最重要的是优化悬浮培养中的细胞浓度和用于感染的杆状病毒上清的体积。如果杆状病毒颗粒与细胞的比值不理想, 杆状病毒的产量可能低于预期 (个人观察, 锰)。
在将杆状病毒上清装入肝素柱上时, 检查可能通过该列的病毒粒子的流动是很重要的。如果出现这种情况, 则可能需要较低的列运行速度, 或者将较小的上清卷加载到该列上。大多数在杆状病毒上清液中存在的污染物在色谱运行的洗涤步骤中被冲刷掉。采用月桂酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 凝胶和电镜研究的银染色法对杆状病毒的纯度进行了评价, 发现我们的纯化杆状质量良好12。
我们仔细地优化了结合条件, 发现波罗斯肝素培养基优于其他肝素培养基 (e. g。HiTrap 或 Capto 肝素) 在其捕获杆状病毒微粒 (个人观察) 的能力。肝素以较高的采样速度和容量结合杆状病毒的能力, 对于减少大规模制造过程的下游加工时间是很重要的。除了杆状病毒外, 肝素培养基还能结合其他对肝素有亲和力的污染蛋白。大多数低分子量的污染可以消除, 包括一个切流过滤 (TFF) 步骤下游肝素色谱运行。TFF 也被用作离心浓缩产品20的替代品。
该协议可用于纯化与肝素有亲和力的其他病毒和蛋白质。但是, 可能需要对洗涤和洗脱缓冲成分和流速进行修改。
重组蛋白的生产工作很好地使用粗杆状病毒上清液直接。因此, 粗杆状病毒可用于重组蛋白的生产。但是, 如果杆状被用作体内基因转移的载体, 或者作为疫苗, 则需要额外的纯化步骤, 如色谱、凝胶过滤和/或离心, 以获得纯和浓缩的杆状病毒。微粒和最小化生产者细胞-和培养基来源的杂质, 以避免毒性, 炎症和免疫反应。
最后, 我们描述了一个简单的协议, 以生产和纯化杆状病毒, 可以放大的生产重组蛋白, 疫苗和基因治疗载体。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作的部分原因是由辛辛那提儿童研究基金会 (CCRF) 为 M.N. 和创新核心赠款提供资金, 该基金由国家卫生研究院促进翻译科学中心资助。奖项编号 UL1 TR001425。 内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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