Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre
Summary
Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.
Abstract
Hematopoetik kök ve progenitör hücre biyolojisi anlayış rejeneratif tıp ve hematolojik patolojiler tedavisi için önemli sonuçları vardır. Vivo modelleri veya birincil kültürler kullanarak elde edilebilir en alakalı verileri rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre düşük bereket önemli ölçüde onların soruşturma için uygun teknikleri havuzu kısıtlar. Bu nedenle, hücre hatları gösterimleri veya büyük hücreli numaraları gerektirir deneyleri için biyolojik malzeme yeterli üretim sağlar. Burada ayrıntılı bir açıklama, okuma ve myelopoiesis ve Nötrofilik farklılaşma gerçekleştirilen işlemlere incelenmesi için kullanılan nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma deneyleri yorumlanması mevcut. Bu deneyler IL-3 huzurunda çoğalırlar ve G-CSF içinde ayırt etmek yeteneği sahip 32D/G-CSF-R sitokin bağımlı fare myeloid hücre kültürünü istihdam. Biz protokolleri 32D/G-CSF-R hücreleri işleme için en iyi duruma getirilmiş sağlamak ve büyük tuzaklar ve açıklanan deneyleri ve beklenen sonuçları tehlikeye atabilir sakıncaları tartışıyorlar. Ayrıca, bu makale için lentiviral ve retroviral üretim, titrasyon ve 32D/G-CSF-R hücre iletim protokolleri içerir. Bu hücrelerin genetik manipülasyon başarılı bir şekilde birincil hematopoetik kök ve progenitör hücre veya vivo içinde modelleri ile elde edilen sonuçlar tamamlayabilir işlevsel ve moleküler çalışmalar gerçekleştirmek için istihdam edilecek göstermektedir.
Introduction
Hematopoetik kök ve yaratıcı nüfus organizma Olgun Hücreler, myeloid silsilesi (nötrofiller, eozinofiller, bazofil ve monosit) hücrelerden de dahil olmak üzere geniş bir dizi sağlar. Hematopoetik kök hücre myeloid hücre üretim sürücüler işlem myelopoiesis bilinir ve değişen taleplerine karşılık olgun myeloid hücrelerin yeterli üretim ile stres organizmanın uygun başa çıkma için bir önkoşuldur koşullar, enfeksiyonlar ve kan kaybı gibi. Olgun myeloid hücrelerin yetersiz üretim yetersizlik patojenler, düşük kan pıhtılaşması ve diğer hayati koşulları1,2ortadan kaldırmak için neden olabilir. Buna ek olarak, değişiklikler Miyeloid lineage gelişiminde de Akut Miyeloid Lösemi (AML)3gibi hematolojik maligniteler ile iliskili olabilir. Değişiklikler myelopoiesis içinde kusurları hücre yüzey reseptörlerinin4, transkripsiyon faktörleri5, değiştirilen ifadeler sinyal yolları6, mutasyonlar oluşumu sonucu Engelli gibi çeşitli nedenlerden dolayı oluşabilir / oncogenes7, ya da Tümör baskılayıcı genler8inactivation aktivasyonu.
Myeloid geliştirme çalışma ve bu süreçte belirli genetik değişiklikler etkisini değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Myelopoiesis eğitim için kullanılan yaygın bir yaklaşım Primer hücre ve transgenik fareler içerir. Bu modelleri biyolojik ilgili verileri edinimi izin rağmen bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Primer hücre kullanımı sınırlı sayıda hücre ve gen ekspresyonu ve daha sonraki biyolojik ya da biyokimyasal analiz değiştirmek için olasılıklar daralma kültür, sınırlı bir süre karşılaşır. Transgenik fareler yüksek maliyetlidir ve biyolojik gerekçe makul bir ölçüde gerektirir. Buna ek olarak, vivo içinde modelleri ile çalışma bir ölçüde ilgi belirli bir süreç içinde bir gen rolünün anlaşılması halinde karmaşıklık ekler. Bu nedenle, bu sınırlamaları aşmak için alternatif yaklaşımlar ihtiyaç vardır. Hücre hatları tartışılmaz avantajı var: (1) onlar biyolojik ve biyokimyasal araştırmalar için yeterli malzeme üreten sağlar sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesine sahip, (2) genetik manipülasyon (nakavt, nakavt, duyarlı oldukları overexpression), (3) maliyeti nispeten düşüktür, ve (4) biyolojik basitleştirme bazı deneysel yaklaşımlar gerekli bir ölçüde olanak tanır.
Ebeveyn IL-3 (İnterlökin-3) bağımlı 32D hücre kültürünü kurulmuştur 1983’te Greenberger ve meslektaşları tarafından enfeksiyon C3H/HeJ fareler arkadaş fare lösemi virüs9ile kemik iliği hücre tarafından. Birkaç 32D klonlar literatürde tarif edildi: cl-239, cl-310ve cl-1011. 32D cl-3 hücreleri IL-3’te çoğalırlar ve granülosit-koloni stimülasyon faktör (G-CSF)10ile tedavi üzerine Nötrofilik farklılaşma tabi gösterilmiştir. Aksine, olurken IL-3 bağımlı, 32D cl-10 hücreleri aslında yanıt G-CSF tedavisi olarak ayırt değil. 1995 yılında Dr Ivo Touw grup retrovirally bu reseptör11işlevsel olarak önemli bölgeleri tanımlamak için 32D cl-10 hücreleri vahşi türü ve G-CSF reseptör (G-CSF-R), mutasyona uğramış formlar transduced. Bu çalışmada IL-3 üzerinde benzer şekilde bağlıdır, 32D/G-CSF-R hücreler nesilde sonuçlandı ama IL-3 G-CSF ile replasmanı sonrası 6-10 gün içinde hücreleri çoğalırlar ve geri dönüşümsüz olgun nötrofiller ayırt durdurmak. Bu özellikleri 32D cl-3 ve iki iyi tanımlanmış büyüme ve farklılaşma faktörlerden – IL-3 ve G-CSF modülasyonlu fare Nötrofilik farklılaşma 32D/G-CSF-R hücreleri Basitleştirilmiş modelleri yapmak. Son yıllarda birden fazla grup nükleer silahların yayılmasına karşı belirli genlerin rol ve farklılaşma myeloid hücre kültürü12,13,14,15 dakika içinde çalışmaya 32D/G-CSF-R hücreleri kullandık , 16ve G-CSF sinyal17,18çalışmaya. Önemlisi, bu hücre satırı kullanarak elde edilen sonuçları Primer hücre ve transgenik fareler16,19,20,21ile elde edilen verilerle ilişkili. Sonuç olarak, 32D/G-CSF-R hücreleri, yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş bir model olmak bu soruyu ele diğer yaklaşımlar ile paralel olarak kullanılan Miyeloid farklılaşma eğitim için değerli bir sistemini temsil inanıyorum.
Burada, 32D/G-CSF-R hücre kullanımı açıklayan ayrıntılı iletişim kuralları, hangi kapak genişleme, farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirilmesi ve bu hücreler farklılaşma sunulur. Detaylı bilgi için 32D/G-CSF-R hücrelerinin genetik değişiklik retroviral veya lentiviral iletim gibi virüs titrasyon için iletişim kuralları tarafından sağlanır. Ayrıca, potansiyel uygulamalar 32D/G-CSF-R hücre göstermek birkaç temsilcisi sonuçları temin edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel bir model seçimi tek araştırma ana sorunlardan biridir. Birincil hayvan ve insan hücreleri en biyolojik ilgili verileri üretmek inanılan bu modeller etik kaygılar içerebilir ve çoğu kez yalıtım/pahalı ve/veya sofistike kültür yordamları ile ilgili. Primer hücre sayıları sınırlıdır ve genetik olarak onları manipüle etmek zordur. Buna ek olarak, Primer hücre veri yorumu29karmaşık hale çeşitli hücre tiplerinin oluşan heterojen bir nüfus temsil eder. Buna ek o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Prof. Ruud Delwel ve Prof. Ivo bize 32D/G-CSF-R hücre satırıyla sağlamak için Touw ve Prof. Dr. Daniel G. Tenen bize Bosc23 hücre satırıyla sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser hibe MA-J için Çek Cumhuriyeti (GACR 15-03796S ve GACR 17-02177S) Grant ajansı tarafından desteklenen, MA-J, GA İngiltere Bursu (Proje No. 341015) Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden çek Bilimler Akademisi (RVO 68378050) desteği MK ve GA İngiltere Bursu (Proje No. 1278217) Prag Charles Üniversitesi PD Prag’a’nden Charles Üniversitesi’nden.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
