Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris
Summary
Ce protocole d’isolement d’îlots a décrit une nouvelle voie d’injection de collagène pour digérer le tissu d’exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s’agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L’isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.
Abstract
Les îlots pancréatiques, également appelés les îlots de Langerhans, sont un groupe de cellules endocriniennes qui produit des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Les îlots se composent principalement de cinq types de cellules sécrétrices d’hormones : les cellules sécrètent le glucagon, les cellules sécrètent l’insuline, les cellules sécrètent la somatostatine, les cellules sécrètent la ghréline et les cellules PP sécrètent du polypeptide pancréatique. Soixante à 80 % des cellules des îlots sont des cellules d’A, qui sont la population cellulaire la plus importante pour étudier la sécrétion d’insuline. Les îlots pancréatiques sont un système modèle crucial pour étudier la sécrétion d’insuline ex vivo. L’acquisition d’îlots de haute qualité est d’une grande importance pour la recherche sur le diabète. La plupart des procédures d’isolement d’înet exigent techniquement difficile d’accéder au site de l’injection de collagène, des procédures dures et complexes de digestion, et des étapes multiples de purification de gradient de densité. Cet article comporte une méthode simple d’isolement d’îlet de souris à haut rendement avec des descriptions détaillées et des démonstrations réalistes, montrant les étapes spécifiques suivantes : 1) injection de collagène P à l’ampulla de Vater, une petite zone joignant le conduit pancréatique et le canal biliaire commun, 2) la digestion enzymatique et la séparation mécanique du pancréas exocrine, et 3) une seule étape de purification de gradient. Les avantages de cette méthode sont l’injection d’enzyme digestive en utilisant l’ampulla plus accessible de Vater, une digestion plus complète en utilisant la combinaison d’approches enzymatiques et mécaniques, et une étape de purification de gradient unique plus simple. Ce protocole produit environ 250 à 350 îlots par souris; et les îlots conviennent à diverses études ex vivo. Les mises en garde possibles de cette procédure sont des îlots potentiellement endommagés en raison de la digestion enzymatique et/ou de l’incubation prolongée de gradient, qui peuvent toutes être en grande partie évitées par la justification d’annonces soigneuses du temps d’incubation.
Introduction
Il y a deux méthodes communes dans la littérature pour l’isolement pancréatique d’îcle. Il faut l’exciser le pancréas et le découper en petits morceaux à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis le digérer dans une solution de collagène1,2,3. Une autre méthode plus précise est d’utiliser le réseau de conduits présents dans le pancréas pour introduire l’enzyme digestive. Les sites suivants ont été utilisés pour l’injection d’enzymes digestives: la jonction de la bile et le conduit cystique, la vésicule biliaire dans le canal biliaire commun, ou le canal biliaire commun lui-même1,4,5. On sait que les îlots ne sont pas répartis uniformément dans le pancréas; la région splénique contient le plus d’îlots6. Alors que la deuxième méthode utilisant des voies anatomiques pour délivrer des enzymes digestives permet une perfusion plus complète du pancréas, y compris la région splénique, cette procédure nécessite souvent le serrage ou la suture de l’ampulla de Vater qui est techniquement qui met au défi. En termes de purification des îlots, des gradients de densité multiples, ainsi que des passoires cellulaires et une rétraction magnétique ont été utilisés pour purifier les îlots3,7. L’utilisation de ces gradients peut prendre du temps et les gradients Ficoll peuvent entraîner des dommages toxiques des îlots8.
Le protocole actuel est construit sur la méthode décrite par Li et al.7, avec des modifications supplémentaires ajoutées basées sur l’expérience de nous-mêmes et d’autres1,4. Les étapes les plus critiques de notre protocole sont le serrage du canal biliaire commun près de l’extrémité du foie, l’injection de collagène P via l’ampulla de Vater pour digérer le tissu exocrine, puis en utilisant un bain d’eau secouant pour accélérer la digestion mécaniquement1, 4,7. Par la suite, une solution «STOP» est appliquée pour inhiber la digestion des îlots; HBSS est utilisé pour laver la solution restante de collagène P et STOP. Lorsque la méthode Ficoll a été utilisée pour purifier les îlots humains, le rendement a été signalé comme étant deux fois plus élevé que les îlots ayant une plus grande capacité fonctionnelle (p. ex., sécrétion d’insuline) par rapport à l’utilisation des gradients Percoll9. Cependant, des études ont remis en question l’utilisation du gradient Ficoll en raison de son effet toxique sur les îlots1,10. Il a été rapporté que le gradient Histopaque fournit la cinétique optimale de purification pour l’isolementd’îlots de souris, qui produit le bon rendement des îlots de haute qualité avec des étapes plus simples et le coût inférieur 1. Dans notre protocole, Histopaque-1077 est utilisé pour purifier les îlots d’autres tissus résiduels8,11. Les îlots récoltés peuvent être cultivés dans des milieux COMPLETs RPMI-1640, ou directement utilisés dans la quantitation d’ARN/protéines.
Notre protocole, utilisant une combinaison de digestion de P de collagène et d’une étape simple de purification de gradient, est plus simple que d’autres protocoles édités. Notre méthode ne nécessite pas d’interventions chirurgicales exigeantes et n’a que quelques étapes simples. Plus important encore, ce protocole produit constamment un bon rendement des îlots fonctionnels de haute qualité (250-350/mouse) comme nous l’avons rapporté12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole comprend la perfusion et la digestion du collagène, suivie s’il y a purification des îlots. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l’injection efficace et la perfusion complète du pancréas1,4,7. La méthode d’administration de ce protocole permet à l’enzyme de traverser les voies anatomiques pour mieux digérer le tissu exocrine entourant les îlots1. En outre, cette techniq…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes extrêmement reconnaissants à Mme Jennifer Munguia pour son illustration artistique du diagramme schématique. Nous remercions M. Michael R. Honig de la station de radio publique communautaire KPFT de Houston pour son aide éditoriale. Cette étude a été soutenue par l’American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS), et NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Ce travail a également été soutenu par l’USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1010840 (YS) et R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
