En simpel højeffektiv protokol til den pankreatiske ø-isolation fra mus
Summary
Denne ø-isolations protokol beskrev en ny rute for kollagenase-injektion for at fordøje det exokrine væv og en forenklet gradient procedure for at rense Holme fra mus. Det involverer enzymatisk fordøjelse, gradient separation/rensning, og ø håndplukning. Vellykket isolation kan give 250 – 350 høj kvalitet og fuldt funktionelle Holme per mus.
Abstract
Pancreasøer, også kaldet Holme af Langerhans, er en klynge af endokrine celler, der producerer hormoner til glukose regulering og andre vigtige biologiske funktioner. Holme består primært af fem typer af hormon-secernerende celler: α celler udskiller Glucagon, β celler udskiller insulin, δ celler udskiller somatostatin, ε celler udskiller Ghrelin, og PP celler udskiller pancreas polypeptid. 60 til 80% af cellerne i Holme er β-celler, som er den vigtigste cellepopulation til at studere insulinsekretionen. Pancreasøer er et afgørende model system til at studere ex vivo insulinsekretion. Erhvervelse af høj kvalitet Holme er af stor betydning for diabetes forskning. De fleste Islet isolation procedurer kræver teknisk vanskeligt at få adgang til stedet for kollagenase injektion, barske og komplekse fordøjelse procedurer, og multiple tæthed gradient rensning trin. Dette papir har en simpel High Yield mus Islet isolation metode med detaljerede beskrivelser og realistiske demonstrationer, der viser følgende specifikke trin: 1) injektion af kollagenase P ved ampulla af Vater, et lille område, der tilmelder sig bugspytkirtlen kanalen og den fælles galdegang, 2) enzymatisk fordøjelse og mekanisk adskillelse af exokrine bugspytkirtlen, og 3) et enkelt gradient rensningstrin. Fordelene ved denne metode er injektion af fordøjelsesenzymer ved hjælp af den mere tilgængelige ampulla af Vater, mere komplet fordøjelse ved hjælp af en kombination af enzymatiske og mekaniske tilgange, og en enklere enkelt gradient rensning trin. Denne protokol producerer ca. 250 — 350 Holme pr. mus; og holme er velegnede til forskellige ex vivo-undersøgelser. Mulige forbehold af denne procedure er potentielt beskadigede Holme på grund af enzymatisk fordøjelse og/eller forlænget gradient inkubation, som alle kan i vid udstrækning undgås ved omhyggelig ad begrundelse af inkubationstiden.
Introduction
Der er to fælles metoder i litteraturen for bugspytkirtlen ø isolation. Man kræver excising bugspytkirtlen og terninger det i små stykker ved hjælp af kirurgisk saks, og derefter fordøje det i en kollagenase løsning1,2,3. En anden mere præcis metode er at bruge nettet af kanaler til stede i bugspytkirtlen til at indføre fordøjelsessystemet enzym. Følgende steder er blevet brugt til fordøjelseskanalen enzym injektion: krydset af galde og cystisk kanal, galdeblæren i den fælles galdegang, eller den fælles galde kanalen selv1,4,5. Det er kendt, at Holme ikke er jævnt fordelt i bugspytkirtlen; milt-regionen indeholder de fleste Holme6. Mens den anden metode ved hjælp af anatomiske veje til at levere fordøjelsesenzymer giver mulighed for en mere komplet perfusion af bugspytkirtlen, herunder splenisk region, denne procedure kræver ofte fastspænding eller suturering af ampulla af Vater, der er teknisk Udfordrende. Med hensyn til ø rensning, flere tæthed gradienter, samt celle sier og magnetisk retraktion er blevet brugt til at rense Holme3,7. Udnyttelsen af disse gradienter kan være tidskrævende og Ficoll gradienter kan resultere i giftige skader af Holme8.
Den nuværende protokol er bygget på den metode, der er beskrevet af Li et al.7, med yderligere ændringer tilføjet baseret på erfaringerne fra os selv og andre1,4. De mest kritiske trin i vores protokol er fastspænding af den fælles galdegang nær leveren ende, indsprøjtning kollagenase P via ampulla af Vater at fordøje den exokrine væv, og derefter ved hjælp af en ryster vandbad til at fremskynde fordøjelsen mekanisk1, 4,7. Efterfølgende anvendes en “STOP”-løsning for at hæmme yderligere fordøjelse af Holme; HBSS bruges til at vaske den resterende kollagenase P og STOP opløsning. Da Ficoll-metoden blev brugt til at rense humane Holme, blev udbyttet rapporteret at være dobbelt så store som Holme med større funktionel kapacitet (f. eks. insulinsekretion) sammenlignet med brugen af Percoll gradienter9. Men, undersøgelser har sat spørgsmålstegn ved brugen af ficoll gradient på grund af dens toksiske virkning på Holme1,10. Det er blevet rapporteret, at den Histuigennemsigtige gradient giver optimal rensning kinetik for mus ø isolation, som giver gode udbytte af høj kvalitet Holme med enklere trin og lavere omkostninger1. I vores protokol, Histuigennemsigtig-1077 bruges til at rense Holme fra andre resterende væv8,11. De høstede Holme kan dyrkes i komplet RPMI-1640 medier, eller direkte udnyttet i RNA/protein kvantitation.
Vores protokol, ved hjælp af en kombination af kollagenase P fordøjelse og en enkelt gradient rensning trin, er enklere end andre offentliggjorte protokoller. Vores metode kræver ikke krævende kirurgiske indgreb og har blot et par enkle trin. Endnu vigtigere, denne protokol konsekvent producerer et godt udbytte af høj kvalitet funktionelle Holme (250-350/mus) som vi rapporterede12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol omfatter kollagenase perfusion og fordøjelse, efterfulgt af rensning af Holme. De mest kritiske trin i denne protokol er effektiv injektion og komplet perfusion af bugspytkirtlen1,4,7. Leveringsmetoden i denne protokol gør det muligt for enzymet at krydse de anatomiske veje for bedre at fordøje det exokrine væv omkring Holme1. Hertil kommer, at denne teknik er velegnet til komplet ford?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er meget taknemmelige for fru Jennifer Munguia for hendes kunstneriske illustration af det skematiske diagram. Vi takker hr. Michael R. Honig på Houstons community Public Radio Station KPFT for hans redaktionelle assistance. Denne undersøgelse blev støttet af American diabetes Association #1-BS-177 (YS) og NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Dette arbejde blev også støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1010840 (YS) og R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
