Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen
Summary
Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.
Abstract
Pankreasinseln, auch Die Inselchen langerhans genannt, sind ein Cluster von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulation und andere wichtige biologische Funktionen produziert. Die Inselchen bestehen in erster Linie aus fünf Arten von hormonsekretierenden Zellen: Zellen sekrete Glucagon, Zellen sezernieren Insulin, Zellen sezernieren Somatostatin, Zellen sezernieren Ghrelin und PP-Zellen sezernieren Pankreaspolypeptid. Sechzig bis 80% der Zellen in den Inselchen sind Zellen, die die wichtigste Zellpopulation sind, um die Insulinsekretion zu untersuchen. Pankreasinseln sind ein entscheidendes Modellsystem zur Untersuchung der Ex-vivo-Insulinsekretion. Der Erwerb hochwertiger Inselchen ist für die Diabetesforschung von großer Bedeutung. Die meisten Isolierungsverfahren auf Der Iseutiniten erfordern technisch schwierigen Zugriff auf die Stelle der Kollagenaseinjektion, harte und komplexe Verdauungsverfahren und Schritte zur Reinigung von Mehrfachdichtegradienten. Dieses Papier verfügt über eine einfache High-Yield-Maus-Insel-Isolationsmethode mit detaillierten Beschreibungen und realistischen Demonstrationen, die die folgenden spezifischen Schritte zeigt: 1) Injektion der Kollagenase P an der Ampulla von Vater, ein kleiner Bereich, der den Pankreaskanal verbindet und der gemeinsame Gallengang, 2) enzymatische Verdauung und mechanische Trennung der exokrinen Bauchspeicheldrüse und 3) ein einziger Gradientenreinigungsschritt. Die Vorteile dieser Methode sind die Injektion des Verdauungsenzyms mit der leichter zugänglichen Ampulla von Vater, eine vollständigere Verdauung mit Kombination enzymatischer und mechanischer Ansätze und ein einfacherer Einzelgradientenreinigungsschritt. Dieses Protokoll erzeugt ca. 250–350 Inselchen pro Maus; und Inselchen eignen sich für verschiedene Ex-vivo-Studien. Mögliche Vorbehalte dieses Verfahrens sind potenziell geschädigte Inseln aufgrund enzymatischer Verdauung und/oder längerer Gradienteninkubation, die alle durch sorgfältige Ad-Begründung der Inkubationszeit weitgehend vermieden werden können.
Introduction
Es gibt zwei gängige Methoden in der Literatur für die Pankreas-Islet-Isolierung. Man erfordert, die Bauchspeicheldrüse auszugraben und mit einer chirurgischen Schere in kleine Stücke zu zersieben und sie dann in einer Kollagenaselösung1,2,3zu verdauen. Eine weitere genauere Methode ist die Verwendung des In-Kanal-Netzwerks in der Bauchspeicheldrüse zur Einführung von Verdauungsenzymen. Folgende Stellen wurden für die Injektion von Verdauungsenzymen verwendet: die Verbindung des Gallen- und Cystkanals, die Gallenblase in den gemeinsamen Gallengang oder der gemeinsame Gallengang selbst1,4,5. Es ist bekannt, dass Inselchen nicht gleichmäßig in der Bauchspeicheldrüse verteilt sind; der Splenic-Bereich enthält die meisten Inselchen6. Während die zweite Methode, die anatomische Wege zur Lieferung von Verdauungsenzymen verwendet, eine vollständigere Durchblutung der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Milzregion, ermöglicht, erfordert dieses Verfahren oft das Spannen oder DasNusn der Ampulla von Vater, die technisch schwierig. In Bezug auf die Inselreinigung wurden mehrfachdichte Gradienten sowie Zellsiebe und magnetischer Rückzug verwendet, um die Inselchen zu reinigen3,7. Die Nutzung dieser Steigungen kann zeitaufwändig sein und die Ficoll-Gradienten können zu toxischen Schäden an Inselchen8führen.
Das aktuelle Protokoll basiert auf der von Li et al.7beschriebenen Methode, wobei zusätzliche Modifikationen hinzugefügt werden, die auf der Erfahrung von uns und anderen basieren1,4. Die kritischsten Schritte unseres Protokolls sind das Spannen des gemeinsamen Gallengangs in der Nähe des Leberendes, das Injizieren der Kollagenase P über die Ampulla von Vater, um das Exokringewebe zu verdauen, und dann mit einem schütteren Wasserbad, um die Verdauung mechanisch zu beschleunigen1, 4,7. Anschließend wird eine “STOP”-Lösung angewendet, um die weitere Verdauung der Inselchen zu hemmen; HBSS wird verwendet, um die verbleibende Kollagenase P und STOP Lösung abzuwaschen. Wenn die Ficoll-Methode verwendet wurde, um menschliche Inselchen zu reinigen, wurde berichtet, dass die Ausbeute doppelt so hoch war wie die Inseln mit größerer Funktioneller Fähigkeit (z. B. Insulinsekretion) im Vergleich zur Verwendung von Percoll-Gradienten9. Studien haben jedoch die Verwendung von Ficoll Gradienten aufgrund seiner toxischen Wirkung auf die Inseln1,10in Frage gestellt. Es wurde berichtet, dass der Histopaque Gradient eine optimale Reinigungskinetik für die Isolierung von Mausinseln bietet, was eine gute Ausbeute an hochwertigen Inselchen mit einfacheren Schritten und niedrigerenKosten1 erzeugt. In unserem Protokoll wird Histopaque-1077 verwendet, um Inselchen aus anderen Restgeweben zu reinigen8,11. Die geernteten Inseln können in kompletten RPMI-1640-Medien kultiviert oder direkt in der RNA/Protein-Quantitation verwendet werden.
Unser Protokoll, das eine Kombination aus Kollagenase P-Verdauung und einem einzigen Gradientenreinigungsschritt verwendet, ist einfacher als andere veröffentlichte Protokolle. Unsere Methode erfordert keine anspruchsvollen chirurgischen Eingriffe und hat nur wenige einfache Schritte. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll konsequent eine gute Ausbeute an hochwertigen funktionstüchtigen Inseln (250-350/Maus) erzeugt, wie berichtet12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll umfasst Kollagenase-Perfusion und Verdauung, gefolgt von der Reinigung von Inselchen. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die effektive Injektion und vollständige Perfusion der Bauchspeicheldrüse1,4,7. Die Abgabemethode dieses Protokolls ermöglicht es dem Enzym, die anatomischen Wege zu durchqueren, um das Exokringewebe, das die Inselchen umgibt, besser zu verdauen1. Darüb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind Frau Jennifer Munguia sehr dankbar für ihre künstlerische Darstellung des Schemas. Wir danken Herrn Michael R. Honig von Houstons Community Public Radio Station KPFT für seine redaktionelle Unterstützung. Diese Studie wurde von der American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS) und NIH R56DK1118334/R01DK118334 (YS) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1010840 (YS) und R01 DK095118 (SG) unterstützt.
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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