चूहे से अग्नाशयी आइलेट अलगाव के लिए एक सरल उच्च दक्षता प्रोटोकॉल
Summary
इस आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल exocrine ऊतक को पचाने के लिए कोलैडेज इंजेक्शन के एक उपन्यास मार्ग और चूहों से islets को शुद्ध करने के लिए एक सरलीकृत ढाल प्रक्रिया का वर्णन किया। यह एंजाइमी पाचन, ढाल जुदाई / शुद्धीकरण, और आइलेट हाथ उठा शामिल है। सफल अलगाव 250-350 उच्च गुणवत्ता और माउस प्रति पूरी तरह कार्यात्मक islets उपज कर सकते हैं.
Abstract
अग्नाशयis, भी Langerhans के Islets कहा जाता है, अंत: स्रावी कोशिकाओं का एक समूह है जो ग्लूकोज विनियमन और अन्य महत्वपूर्ण जैविक कार्यों के लिए हार्मोन का उत्पादन कर रहे हैं. इसलेट्स में मुख्य रूप से पांच प्रकार की हार्मोन-स्रावित कोशिकाएं होती हैं: जेड कोशिकाएं ग्लूकागन को स्रावित करती हैं, जेड कोशिकाएं इंसुलिन को स्रावित करती हैं, जेड कोशिकाओं को सोमेटोस्टेटिन, जेड कोशिकाओं को स्रावित करता है। इस्लेट्स में 60 से 80% कोशिकाएं हैं- कोशिकाएं, जो इंसुलिन स्राव का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कोशिका जनसंख्या हैं। अग्नाशयी आइलेट्स पूर्व विवो इंसुलिन स्राव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। मधुमेह अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता islets प्राप्त बहुत महत्व का है. अधिकांश आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं कोकोलैनेज इंजेक्शन, कठोर और जटिल पाचन प्रक्रियाओं, और कई घनत्व ढाल शुद्धि कदम की साइट का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल की आवश्यकता होती है। इस कागज विस्तृत विवरण और यथार्थवादी प्रदर्शनों के साथ एक सरल उच्च उपज माउस आइलेट अलगाव विधि सुविधाएँ, निम्नलिखित विशिष्ट चरणों दिखा: 1) Vater के ampulla पर collagenase पी का इंजेक्शन, एक छोटा सा क्षेत्र अग्नाशय ीduct में शामिल होने और आम पित्त नली, 2) एंजाइमी पाचन और एक्सोक्रिन अग्न्याशय के यांत्रिक जुदाई, और 3) एक एकल ढाल शुद्धि कदम. इस विधि के लाभ Vater के अधिक सुलभ ampulla का उपयोग कर पाचन एंजाइम के इंजेक्शन, एंजाइमी और यांत्रिक दृष्टिकोण के संयोजन का उपयोग कर अधिक पूरा पाचन, और एक सरल एकल ढाल शुद्धि कदम हैं. यह प्रोटोकॉल प्रति माउस लगभग 250-350 islets उत्पन्न करता है; और islets विभिन्न पूर्व vivo अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं. इस प्रक्रिया के संभावित चेतावनी एंजाइमी पाचन और/या लंबे समय तक ढाल ऊष्मायन के कारण संभावित रूप से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, जिनमें से सभी को ऊष्मायन समय के सावधानीपूर्वक विज्ञापन औचित्य से काफी हद तक बचा जा सकता है।
Introduction
अग्नाशयी आइलेट अलगाव के लिए साहित्य में दो आम तरीके हैं. एक अग्न्याशय excising और यह शल्य कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में dicing की आवश्यकता है, और फिर यह एक कोलैजा समाधान में पचा1,2,3. एक और अधिक सटीक विधि पाचन एंजाइम परिचय करने के लिए अग्न्याशय में मौजूद नलिकाओं के नेटवर्क का उपयोग करने के लिए है। निम्नलिखित साइटों पाचन एंजाइम इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है: पित्त और सिस्टिक नलिका के जंक्शन, सामान्य पित्त नली में पित्ताशय की थैली, या आम पित्त नली ही1,4,5. यह ज्ञात है कि islets समान रूप से अग्न्याशय में वितरित नहीं कर रहे हैं; स्प्लेनिक क्षेत्र में सबसे अधिक आइलेट्स6होते हैं। जबकि पाचन एंजाइमों को वितरित करने के लिए शारीरिक मार्गों का उपयोग करने की दूसरी विधि अग्न्याशय का एक अधिक पूर्ण प्रसार के लिए अनुमति देता है, प्लीहा क्षेत्र सहित, इस प्रक्रिया को अक्सर शिकंजा या Vater के ampulla के suturing की आवश्यकता है कि तकनीकी रूप से है चुनौतीपूर्ण. आइलेट शोधन के संदर्भ में अनेक घनत्व प्रवणता तथा कोशिका प्रभेदकतथा चुंबकीय प्रत्याकर्षण का प्रयोग आइलेट्स3,7को शुद्ध करने के लिए किया गया है। इन प्रवणताओं का उपयोग समय लगता है और फिकॉल ग्रेडिएंट के परिणामस्वरूप आइलेट्स8की विषाक्त क्षति हो सकती है .
वर्तमान प्रोटोकॉल ली एट अल द्वारा वर्णित विधि पर बनाया गया है,अतिरिक्त संशोधनों के साथ अपने आप को और दूसरों के अनुभव के आधार पर जोड़ा1,4. हमारे प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम जिगर के अंत के पास आम पित्त नली के clamping रहे हैं, Vater के ampulla के माध्यम से कोलैनाज पी इंजेक्शन एक्सोक्रिन ऊतक पचाने के लिए, और फिर एक मिलाते हुए पानी स्नान का उपयोग करने के लिए पाचन यंत्रवत्1, 4,7. बाद में, आइलेट्स के आगे पाचन को बाधित करने के लिए एक ‘STOP’ समाधान लागू किया जाता है; HBSS शेष collagenase पी और बंद करो समाधान धोने के लिए प्रयोग किया जाता है. जब फिकॉल विधि का उपयोग मानव आइलेट्स को शुद्ध करने के लिए किया गया था, तो पर्कॉल ग्रेडिएंट्स9के उपयोग की तुलना में उपज को अधिक कार्यात्मक क्षमता (उदाहरण के लिए, इंसुलिन स्राव) के साथ दो बार आइलेट्स होने की सूचना दी गई थी। तथापि, अध्ययनों से आईलेट्स1,10पर इसके जहरीले प्रभाव के कारण फिकॉल ग्रेडिएंट के उपयोग पर प्रश्न उठाया गया है। यह सूचित किया गया है कि हिस्टोपैकी प्रवणता माउस आइलेट आइसोलेशन के लिए इष्टतम शुद्धि गतिज प्रदान करती है, जो सरल चरणों और कम लागत1के साथ उच्च गुणवत्ता वाले आइलेट्स की अच्छी उपज पैदा करती है। हमारे प्रोटोकॉल में, हिस्टोपाक-1077 का उपयोग अन्य अवशिष्ट ऊतक8,11से आइलेट्स को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। काटा islets पूर्ण RPMI-1640 मीडिया में सुसंस्कृत किया जा सकता है, या सीधे आरएनए में उपयोग /
हमारे प्रोटोकॉल, collagenase पी पाचन और एक एकल ढाल शुद्धि कदम का एक संयोजन का उपयोग कर, अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में सरल है. हमारी विधि शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की मांग की आवश्यकता नहीं है और बस कुछ ही सरल कदम है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल लगातार उच्च गुणवत्ता कार्यात्मक islets (250-350/
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कोलाजनेस भ्रम और पाचन शामिल है, इसके बाद आइलेट्स की शुद्धि की जाती है। इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रभावी इंजेक्शन और अग्न्याशय के पूर्ण भ्रमहैं 1,4,<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम योजनाबद्ध आरेख के अपने कलात्मक चित्रण के लिए सुश्री जेनिफर Munguia के लिए अत्यंत आभारी हैं. हम अपने संपादकीय सहायता के लिए ह्यूस्टन के सामुदायिक सार्वजनिक रेडियो स्टेशन KPFT में श्री माइकल आर Honig धन्यवाद. इस अध्ययन अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन #1-15-बीएस-177 (वाईएस), और NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS) द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य एवं कृषि संस्थान, हैच परियोजना 1010840 (वाईएस) और आर01 डीके095118 (एसजी) द्वारा भी सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
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