Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem
Summary
Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.
Abstract
Gene manipülasyon özellikle kalbinde önemli ölçüde soruşturma kalp hastalığı pathomechanisms ve tedavi potansiyellerini artırmak. Vivo kalp özel gen teslim sık sistemik veya yerel teslim tarafından elde edilir. Kuyruk ven yoluyla sistemik enjeksiyon kolay ve verimli kardiyak gen ekspresyonu rekombinant adeno ilişkili virüs 9 (AAV9) kullanarak işleme. Ancak, bu yöntem için verimli iletim vektör nispeten yüksek miktarda gerektirir ve nontarget organ gen iletim neden olabilir. Burada, intramyocardial enjeksiyon vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde için bir basit, etkili ve zaman kazandıran yöntemi açıklanmaktadır. Anestezi (havalandırma) olmadan altında göğüs birincil ve ikincil kasları açık açık disseke ve fare kalp hızlı bir şekilde dördüncü interkostal alan küçük bir kesi yoluyla el ile dışa tarafından maruz kalmış. Daha sonra luciferase (Luc) ve vitamin D reseptör (VDR) veya VDR, hedefleme kısa saç tokası RNA (shRNA) kodlama adenovirus Hamilton şırınga Miyokardiyum enjekte ettiler. Sonraki vivo içinde görüntüleme bu luciferase özellikle kalbinden başarılı bir şekilde overexpressed gösterdi. Ayrıca, Western blot analizi başarılı overexpression veya fare kalbinde VDR susturmak doğruladı. Kez hakim, bu teknik gen manipülasyon yanı sıra enjeksiyon hücreleri veya fare kalbinde nanogels gibi diğer malzemeler için kullanılabilir.
Introduction
Kalp hastalığı morbidite ve mortalite dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Miyokard İnfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi ölümcül kalp sorunları için etkili tedavi stratejileri eksikliği temel pathomechanisms yoğun keşfi ve kimliği roman tedavi olanakları3çekiyor. Bu bilimsel keşifler için yaygın olarak kullanılan4,5kalp özel gen manipülasyon olduğunu. Kardiyak gen manipülasyon güçlü transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz (TALEN) kullanarak genom düzenleyerek elde edilebilir ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş / CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) araçları, ya da Ektopik genetik malzemelerin (örneğin, virüs vektörel çizimler proteinler ilgi kodlama genleri taşıyan) teslim edilmesi6. Genom düzenleme kesin ve kronolojik zamanmekansal genom değişiklikler yaşayan fareler sağlar rağmen hala bir zaman alıcı ve emek yoğun pratik6olduğunu. Alternatif olarak,6kalp özel gen manipülasyon virüs vektör veya küçük müdahale RNA (siRNA) karmaşık teslim rutin tarafından gerçekleştirilen.
Virüs vektör teslim yetişkin fare kalp için kabaca iki stratejileri ile elde edilir: sistemik veya yerel enjeksiyon. AAVs AAV9 gibi cardiotropic serotip sistemik enjeksiyon noninvaziv kardiyak belirli bir gen manipülasyon7için. Ancak, bu yöntem vektör verimli iletim ve gen ekspresyonu için gerekli nispeten yüksek miktarda gerektirir ve kas ve karaciğer7gibi nontarget organların önemli iletim neden olabilir. Yerel virüs enjeksiyon intramyocardial enjeksiyon veya intrakoroner teslim7tarafından sağlanır. İntrakoroner teslim virüs intramyocardial enjeksiyon için karşılaştırıldığında kalp içinde daha eşit dağılımı yol açar. Ancak, bu teknik dezavantajları sistemik dolaşım ve iletim nontarget organları8ve onun gereksinimi için basınç ölçüm işlemi sırasında aygıt için viral vektörler dışarı hızlı yıkama vardır. Buna karşılık, viral olarak dağıtabilmenizi daha iyi virüs saklama Miyokardiyum yanı sıra site belirli teslim, ama başarısız intramyocardial enjeksiyon sağlar7vektör. Küçük hayvanlar için intrakoroner teslimat sistemik AAV9 enjeksiyon ve intramyocardial enjeksiyon daha yaygın olarak uygulanan4,5,7iken yapmak teknik olarak zor olur. Sistemik enjeksiyon gerçekleştirmek kolay olsa da, geleneksel intramyocardial enjeksiyon mekanik havalandırma ve Torakotomi gerektiren, geniş doku hasarına neden olur ve zaman alır.
Bu raporda, intramyocardial enjeksiyon için bir kolay, zaman tasarrufu ve yüksek verimli yöntemi açıklanmıştır. Luciferase ve VDR veya VDR, hedefleme shRNA kodlama adenovirus kardiyak gen ekspresyonu işlemek için enjekte ettiler. Hakim sonra gene manipülasyon, aynı zamanda hücreleri ve fare kalp diğer maddeleri enjeksiyonu için bu yöntem kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli raporu miyokard infarktüsü indüksiyon bir yönteminden Gao vd tarafından güncellenmiştir kardiyak gen manipülasyon için viral vektörler intramyocardial enjeksiyon için değiştirilmiş bir teknik gösterir 13 şu anda, karakterizasyonu vivo içinde belirli bir gen fonksiyonları en sık dahil nakavt veya transgenik fareler3,14,15,16<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Bilim Fonu tarafından desteklenen ayırt edici genç akademisyenler (81625002), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81470389, 81270282, 81601238), Program Shanghai akademik araştırma, lider (18XD1402400), Şangay belediye için Eğitim Komisyonu Gaofeng klinik tıp hibe desteği (20152209), Shanghai Shenkang hastane Geliştirme Merkezi (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp (15ZH1003 ve 14XJ10019), Shanghai yelken programı (18YF1413000) ve Bengbu Tıp Fakültesi (Byycx1722) yüksek lisans yenilik programı. Dr. Erhe Gao bizim laboratuarımızda onun önceki yardım için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
