Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse
Summary
We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.
Abstract
Afdelen via het insluiten van paraffine is een grotendeels gevestigde techniek in eukaryotische systemen. Wij bieden hier een methode voor de fixatie, insluiten, en segmenteren van intact microbiële kolonie biofilms gebruik van paraffine geperfundeerd. Aan te passen deze methode voor gebruik op de kolonie biofilms, we ontwikkelde technieken voor het behoud van elk monster op het substraat van de groei en het lamineren met een agar-overlayer, en lysine toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing. Deze optimalisaties verbeteren monster bewaring en het behoud van micromorphological functies. Monsters voorbereid op deze wijze zijn vatbaar voor dunne segmenteren en imaging door licht, fluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie. Wij hebben deze techniek toegepast om de kolonie biofilms van Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisen Vibrio cholerae. Het hoge niveau van detail zichtbaar in de monsters die zijn gegenereerd door deze methode, gecombineerd met verslaggever stam engineering of het gebruik van bepaalde kleurstoffen, spannende inzichten in de Fysiologie en de ontwikkeling van microbiële gemeenschappen kan bieden.
Introduction
Meeste microben hebben de capaciteit om formulier biofilms, samengehouden gemeenschappen van cellen door zelf geproduceerde matrices. Biofilms kunnen worden gekweekt in vele soorten van fysieke setups, met verschillende regimes van nutriënten en substraat bepaling. Specifieke tests voor biofilm vorming neiging om opbrengst reproduceerbare meercellige structuren, en gemeenschappelijke platforms voor fylogenetisch divers soort de Gemeenschap of de macroscopische niveau in acht worden genomen. Wanneer microben zijn gegroeid als kolonies op solide medium onder een atmosfeer, macroscopische morfologie brengt informatie over de capaciteit voor de productie van de matrix en vaak correleert met andere eigenschappen 1,2,3. De interne architectuur van microbiële kolonies bieden ook aanwijzingen met betrekking tot de biofilm-specifieke chemie en fysiologie, maar moeizaam te karakteriseren. Recente toepassingen van cryoembedding en cryosectioning technieken aan bacteriële kolonies hebben ingeschakeld beeldvorming en visualisatie van specifieke kenmerken op ongekende resolutie 4,5,6. Studies met dierlijk weefsel hebben echter aangetoond dat paraffine insluiten biedt superieure behoud van morfologie in vergelijking met cryoembedding 7 en is gebruikt voor het visualiseren van bacteriën in weefsels 8,9. Daarom hebben we een protocol voor fixatie, paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie biofilms ontwikkeld. Hier beschrijven we de voorbereiding van Pseudomonas aeruginosa PA14 kolonie-biofilm dunne secties 10,11, maar we hebben ook met succes deze techniek toegepast om biofilms gevormd door de bacteriën Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, en Vibrio cholerae12.
Het proces van paraffine-insluiting en dun-afdelen biofilms volgt een eenvoudige logica. Ten eerste, de biofilms zijn ingekapseld in een laagje agar morfologie behouden tijdens de verwerking. Ten tweede, de ingekapseld-biofilms zijn ondergedompeld in een hechtmiddel aan dwarslijn macromoleculen en micromorfologie behouden. Deze zijn vervolgens gedehydrateerde met alcohol, gewist met een meer niet-polair oplosmiddel en vervolgens geïnfiltreerd met vloeibare paraffine. Zodra het geïnfiltreerd, worden de monsters ingebed in de wax blokken voor het segmenteren. Secties zijn gesneden, gemonteerd op dia’s en vervolgens gerehydrateerd om hen terug te keren naar een meer oorspronkelijke staat. Vanaf dit punt, kunnen zij worden gekleurd of bedekt met montage medium voor microscopische analyse.
Dit protocol produceert dunne secties van microbiële biofilms geschikt voor histologisch analyse. Kolonie biofilm substructuren worden weergegeven als dunne secties opgesteld op basis van deze methode zijn beeld door de lichte microscopie. Biofilms kunnen ook worden gekweekt op media met fluorescerende vlekken specifiek voor afzonderlijke functies of gekleurd bij de rehydratie stap, onmiddellijk voorafgaand aan de montage (stappen 9.5-9.6). Ten slotte kunnen microben worden ontworpen om te produceren van fluorescente proteïnen in een constitutief of gereglementeerde mode waardoor in situ rapportage van de cel distributie of gen expressie binnen deze Gemeenschappen. We hebben deze methoden gebruikt om te bepalen van de kolonie biofilm diepte, cel distributie, verdeling van de matrix, groeipatronen en Spatio genexpressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Paraffine-insluiting en dun-afdelen weefselsteekproeven is een klassieke histologische techniek die toelaat beeldvorming van micro-morfologische structuren en wordt vaak gebruikt op eukaryotische weefsels, en met enig succes is vereffend met microbiële monsters8 ,9. Terwijl cryoembedding voor sterke eigendomsvoorbehoud endogene en immunefluorescentie signaal zorgt, is het insluiten van paraffine over het algemeen beter als het biedt beter behoud van morfologie<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NSF carrière AWARD 1553023 en NIH/NIAID award R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
