中枢神经元轴突静脉曲张形成和恢复的 Microbiomechanical 系统研究
Summary
本协议描述了一种生理上相关的加压液方法, 用于快速可逆地诱导神经元中的静脉曲张。
Abstract
轴突静脉曲张是在高异质性的轴轴上扩大结构。它们不仅存在于神经退行性疾病或损伤的大脑中, 还存在于正常大脑中。在这里, 我们描述了一个新建立的微机械系统快速, 可靠, 可逆诱发轴突静脉曲张, 使我们能够理解的机制, 控制静脉曲张形成和异构蛋白组成。该系统代表了一种新的方法来评估压缩和剪切应力对不同的神经元亚细胞间隔的影响, 不同于其他体外系统, 主要集中于伸展作用。重要的是, 由于系统的独特性, 我们最近提出了一种新的发现, 即加压液的应用可以通过瞬态受体电位通道的活化, 快速、可逆地诱发轴突静脉曲张。我们的生物力学系统可以方便地与药物灌注、活细胞成像、钙成像和膜片钳记录结合使用。因此, 该方法可用于研究 mechanosensitive 离子通道、轴突转运调节、轴突细胞骨架动力学、钙信号传递以及与颅脑损伤相关的形态学变化。
Introduction
静脉曲张形成, 或肿胀/珠, 沿轴突, 是一个突出的特点变性观察到许多疾病或损伤的中枢神经系统, 包括多发性硬化症, 阿尔茨海默病, 帕金森病, 和创伤脑损伤1,2。尽管轴突静脉曲张对动作电位传播和突触传输有显著的生理影响3, 但如何生成静脉曲张仍然不得而知。最近, 利用新建立的 microbiomechanical 对啮齿动物培养的海马神经元进行了检测, 发现机械刺激能诱发这些神经元中的静脉曲张, 具有极具吸引力的特征。第一, 静脉曲张诱导迅速 (< 十年代), 这个过程是出乎意料的可逆的。其次, 静脉曲张的萌生取决于膨化压力的强度: 压力越大, 启动速度越快。第三, 静脉曲张的萌生取决于神经元的年龄。与较旧的神经元相比, 年轻神经元的轴突对机械应力的反应更大。第四, 静脉曲张沿海马神经元的轴突形成, 而这些神经元的树突和初始轴突段在同一膨化条件下无变化。因此, 我们的研究揭示了一种新的神经极性特征。这些发现与体外系统在生理上是相关的。使用体内模型进行轻度创伤性脑损伤 (mTBI), 我们表明, 轴突静脉曲张在小鼠体感皮层的多焦点模式下, 在闭合颅骨撞击后立即形成, 与我们的体内一致。结果4。值得注意的是, 我们的 mTBI 小鼠的染色和成像只提供了神经元形态学变化的快照, 因为执行体内的神经元形态学在机械撞击过程中的时间推移成像仍然是不可行的。
这种液体膨化系统不仅使我们能够捕捉到与机械应力引起的静脉曲张形成相关的独特特征, 而且还可以确定其内在机制。通过对不同细胞外溶液、mechanosensitive 离子通道不同候选者的阻滞剂和开启器的测试, 以及细胞电生理学, 我们确定了瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 4 (TRPV4)可渗透到 Ca2 +和 Na+并由膨化激活的通道主要负责检测轴突静脉曲张形成的初始机械应力4。这进一步证实了以 siRNA 淘汰赛方法。结合这一新的实验系统, 我们开发了海马神经元培养, 对于研究中枢神经元的微机械特性, 特别是与其他技术相结合, 具有重要的价值。
我们建立的这一微机械系统是独一无二的, 不同于以前存在的系统在几个主要方面。首先, 在这个系统中, 神经元在压缩和剪切的形式中经历了平面外的机械应力。在机械撞击过程中, 神经元的过程仍然附着在盖玻片表面, 不移动。这与其他主要涉及弯曲和平面拉伸 (或张力) 的实验系统不同, 例如, 捆绑轴突的偏转, 如移动字符串5,6或在 micropatterned 上生长的拉伸轴突。通道和伸缩膜7,8。此外, 虽然轴突静脉曲张也可以在这些化验中诱发像我们的液体膨化系统, 这些设置的过程需要更多的时间 (从10分钟到几个小时6,7,8), 并出现不可逆转。最后, 我们的系统使用局部液体膨化允许检查静脉曲张形成的空间特征 (e. g., 树突, 树枝状刺, 躯体, 轴突的初始段, 轴突终端), 除了它的世俗特征。利用该系统, 我们发现了轴突静脉曲张形成的几种意想不到的独特特征, 特别是快速发作、慢可逆性和轴突-枝晶极性。
本文所讨论的系统与多种分子和细胞生物学技术相适应。例如, 研究机械应激对神经元形态和功能的影响, 可与髓鞘共培养、荧光共振能量转移 (焦虑) 的时移成像和全内反射荧光 (TIRF) 一起使用,钙成像和膜片钳记录。本文重点讨论了系统的核心组件。海马神经元培养, 液体膨化设置, 高分辨率的轴突传输的时间推移成像, 和钙成像, 说明了逐步下一步。
Protocol
Representative Results
Discussion
这 microbiomechanical 化验的程序是直接的。它将产生可靠的结果, 如果所有的步骤都仔细执行。有几个关键步骤, 如果执行不当, 将阻碍成功的数据收集。关键步骤从实际应用到膨化刺激的上游开始。仔细解剖, 培养和照顾的主要神经元培养是至关重要的。如果培养的神经元不健康, 它们就不会持续反应, 因为它们可能已经被灌输给压力。下游的文化, 初始设置和校准的膨化设备提供一致的压力, 这将诱?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所有动物实验都是按照国家卫生研究院动物使用指南进行的。这项工作部分是由国立卫生研究院 (R01NS093073 和 R21AA024873) 提供给 c。
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
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