Et Microbiomechanical System for at studere Varicosity dannelse og opsving i centrale Neuron Axons
Summary
Denne protokol beskriver en fysiologisk relevante, trykisoleret væske tilgang for hurtige og reversible induktion af varicosities i neuroner.
Abstract
Cytoskeletale varicosities er udvidede strukturer langs skafter af axoner med en høj grad af heterogenitet. De er til stede i hjerner med neurodegenerative sygdomme eller skader, men også i den normale hjerne. Her, beskriver vi et nyligt etableret micromechanical system hurtigt, pålideligt og reversibelt fremkalde cytoskeletale varicosities, tillader os at forstå de mekanismer, der regulerer varicosity dannelse og heterogene protein sammensætning. Dette system repræsenterer en roman midler til at vurdere virkningerne af kompression og shear stress på forskellige subcellulært rum af neuroner, adskiller sig fra andre in vitro- systemer, der hovedsagelig fokusere på effekten af stretching. Vigtigere, på grund af de unikke funktioner i vores system gjorde vi for nylig en nye opdagelse viser, at anvendelsen af trykisoleret væske kan hurtigt og reversibelt fremkalde cytoskeletale varicosities gennem aktivering af en forbigående receptor potentielle kanal. Vores biomekaniske system kan blive udnyttet bekvemt i kombination med narkotika perfusion, levende celle imaging, calcium imaging og patch klemme optagelse. Denne metode kan derfor vedtages for at studere mechanosensitive Ionkanaler, cytoskeletale transport forordning, cytoskeletale cytoskeleton dynamics, calcium signalering og morfologiske ændringer relateret til traumatisk hjerneskade.
Introduction
Varicosity dannelse eller hævelse/beading, langs axoner, er et fremtrædende træk ved neurodegeneration observeret i mange lidelser eller skader i centralnervesystemet, herunder multipel sclerose, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, og traumatisk hjernen skade1,2. Trods de betydelige fysiologiske virkninger af cytoskeletale varicosities på aktionspotentialet formering og synaptisk transmission3forbliver hvor varicosities genereres ukendt. For nylig, ved hjælp af en nyligt oprettede microbiomechanical analyse på kulturperler hippocampus neuroner fra gnavere, vi fandt, at mekaniske stimuli kan fremkalde varicosities i disse neuroner med meget spændende funktioner. Første varicosity induktion er hurtig (< 10 s), og denne proces er uventet reversibel. Andet, varicosity indledning afhænger af styrken puffing pres: jo højere tryk, jo hurtigere indledning. For det tredje afhænger varicosity indledning af neuronal alder. Axoner af yngre neuroner vises mere lydhøre over for mekanisk stress, sammenlignet med dem af ældre neuroner. Fjerde, formen varicosities langs axoner af hippocampus neuroner, mens dendritter og indledende axon segmenter af disse neuroner viser ingen ændring på samme stønnende betingelse. Således, vores undersøgelse afslørede en roman funktion af neuronal polaritet. Disse resultater med in vitro -system er fysiologisk relevante. Ved hjælp af en i vivo model for mild traumatisk hjerneskade (mTBI), viste vi at cytoskeletale varicosities udviklet i en multi-focal mode i den somatosensoriske cortex af musene umiddelbart efter tæt-kraniet indvirkning, i overensstemmelse med vores in vitro- resultater4. Det er vigtigt at bemærke, at vores farvning og billeddannelse af mTBI mus kun give et snap shot af neuronal morfologiske ændringer, siden udfører i vivo time-lapse billeddannelse af neuronal morfologi under en mekanisk påvirkning er stadig ikke muligt.
Denne væske-puffing system tilladt os at fange unikke funktioner forbundet med mekanisk stress-induceret varicosity dannelse, men også til at bestemme den underliggende mekanisme. Ved at teste forskellige ekstracellulære løsninger, blokkere og oplukkere for forskellige kandidater mechanosensitive Ionkanaler, og cellulære Elektrofysiologi, konstateret vi at den forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 4 (TRPV4) kanal, der er gennemtrængelig for Ca2 + og Na+ og aktiveres ved puffing er hovedsagelig ansvarlige for afsløring indledende mekanisk stress under cytoskeletale varicosity dannelse4. Dette blev yderligere bekræftet med siRNA knockout tilgang. Taget sammen, denne nye analyse system vi har udviklet med hippocampus neuron kultur, er meget værdifuldt for at studere micromechanical egenskaber af centrale neuroner, især i kombination med andre teknikker.
Dette micromechanical system har vi etableret er unik og adskiller sig fra de tidligere eksisterende systemer i flere vigtige aspekter. Først, i dette system, neuronerne erfaring ud af flyet mekanisk stress i form af kompression og klipning. Under den mekanisk påvirkning, neuronal processer forbliver knyttet til coverslip overfladen og flytte ikke. Dette adskiller sig fra andre eksperimentelle systemer, der hovedsagelig involveret bøjning og i flyet stretching (eller spænding), for eksempel, afbøjning af bundtet axoner gerne flytte strings5,6 eller strække axoner dyrkes på micropatterned kanaler og elastisk membraner7,8. Desuden, selvom cytoskeletale varicosities kan også induceres i disse assays ligesom i vores væske-puffing system, processen i disse indstillinger tager meget længere tid (fra 10 min. til flere timer6,7,8) og vises irreversibel. Endelig, vores system ved hjælp af lokale væske puffing giver mulighed for undersøgelse af de fysiske funktioner af varicosity dannelse (fx., dendritter, dendritiske pigge, soma, cytoskeletale indledende segmenter, cytoskeletale terminaler), ud over dens tidsmæssige funktioner. Ved hjælp af dette system, opdagede vi flere uventede og unikke funktioner af cytoskeletale varicosity dannelse, især hurtigt indsættende, langsom reversibilitet og axon-dendrit polaritet.
Det system, som vi diskuterer i dette papir er kompatibel med mange teknikker til molekylære og Cellens biologi. For eksempel, for at studere virkningerne af mekanisk stress på neuronal morfologi og funktion, kan det bruges sammen med myelin coculture, time-lapse imaging af fluorescerende resonans energioverførsel (FRET) og total interne reflection fluorescens (JOHANNAS), calcium billeddannelse, og lappe klemme optagelse. I dette papir fokuserer vi på centrale elementer i systemet. Hippocampus neuron kultur, væske-puffing opsætning, høj opløsning time-lapse tænkelig nemlig cytoskeletale transport og calcium imaging er illustreret trin for trin nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proceduren for denne microbiomechanical assay er ligetil. Det vil producere pålidelige resultater, hvis alle dets trin udføres omhyggeligt. Der er flere vigtige skridt, der hvis forkert udført, vil hindre vellykket dataindsamling. De kritiske trin begynder opstrøms af den faktiske anvendelse af stønnende stimulus. Omhyggelig dissektion, dyrkning og pleje af den primære neuron kultur er i højsædet. Hvis de kulturperler neuroner ikke er sundt, vil de ikke reagere konsekvent, da de måske har allerede blevet grundma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle dyreforsøg har gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhed dyr brug retningslinjer. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01NS093073 og R21AA024873) til C. Gu.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
