मध्य ंयूरॉन Axons में अध्ययन Varicosity गठन और वसूली के लिए एक Microbiomechanical प्रणाली
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक, दबाव द्रव दृष्टिकोण तेजी से और प्रतिवर्ती varicosities के ंयूरॉंस में प्रेरण ।
Abstract
Axonal varicosities axons की शाफ्ट के साथ विविधता के एक उच्च डिग्री के साथ बढ़े हुए संरचनाओं हैं । वे न केवल neurodegenerative रोगों या चोटों के साथ दिमाग में मौजूद हैं, लेकिन यह भी सामान्य मस्तिष्क में. यहां, हम एक नव स्थापित micromechanical प्रणाली का वर्णन तेजी से, मज़बूती से, और reversibly axonal varicosities प्रेरित, हमें varicosity गठन और विषम प्रोटीन संरचना शासी तंत्र को समझने की अनुमति । इस प्रणाली के एक उपंयास का प्रतिनिधित्व करता है ंयूरॉंस के विभिंन उपसेलुलर डिब्बों पर संपीड़न और कतरनी तनाव के प्रभाव का मूल्यांकन करने का मतलब है, अंय इन विट्रो प्रणालियों है कि मुख्य रूप से खींच के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित अंय से अलग । महत्वपूर्ण बात, हमारी प्रणाली की अनूठी विशेषताओं के कारण, हम हाल ही में एक उपंयास दिखा कि दबाव द्रव के आवेदन तेजी से और reversibly एक क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल के सक्रियकरण के माध्यम से axonal varicosities प्रेरित कर सकते है खोज की है । हमारे यांत्रिक प्रणाली दवा छिड़काव, लाइव सेल इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में आसानी से उपयोग किया जा सकता है । इसलिए, इस विधि mechanosensitive आयन चैनलों, axonal परिवहन विनियमन, axonal cytoskeleton गतिशीलता, कैल्शियम संकेतन, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट से संबंधित रूपात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अपनाया जा सकता है ।
Introduction
Varicosity गठन, या सूजन/मनके, axons के साथ, कई विकारों या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की चोटों में मनाया neurodegeneration की एक प्रमुख विशेषता है, कई स्केलेरोसिस सहित, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट1,2. कार्रवाई संभावित प्रसार और synaptic संचरण3पर axonal varicosities के महत्वपूर्ण शारीरिक प्रभावों के बावजूद, कैसे varicosities उत्पन्न कर रहे हैं अज्ञात रहता है. हाल ही में, एक नए स्थापित microbiomechanical हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस पर कुतर से, हमने पाया है कि यांत्रिक उत्तेजनाओं अत्यधिक पेचीदा सुविधाओं के साथ इन ंयूरॉंस में varicosities प्रेरित कर सकते है का उपयोग कर । पहले, varicosity प्रेरण तीव्र है (< 10 s) और यह प्रक्रिया अनपेक्षित रूप से प्रतिवर्ती है । दूसरा, varicosity दीक्षा दबाव puffing की ताकत पर निर्भर करता है: उच्च दबाव, तेजी से दीक्षा । तीसरा, varicosity दीक्षा न्यूरॉन उम्र पर निर्भर करता है । छोटे न्यूरॉन्स के axons अधिक यांत्रिक तनाव के लिए उत्तरदायी दिखाई देते हैं, पुराने न्यूरॉन्स की तुलना में. चौथा, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के axons साथ varicosities फार्म, जबकि dendrites और इन न्यूरॉन्स के प्रारंभिक axon क्षेत्रों में एक ही puffing हालत के तहत कोई परिवर्तन प्रदर्शित. इस प्रकार, हमारे अध्ययन के एक उपंयास सुविधा का पता चला ंयूरॉन ध्रुवीयता । इन विट्रो प्रणाली के साथ इन निष्कर्षों को शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं । हल्के दर्दनाक मस्तिष्क चोट (mTBI) के लिए एक vivo में मॉडल का उपयोग कर, हम axonal varicosities एक बहु में विकसित किया गया है कि चूहों के तुरंत बाद बंद खोपड़ी प्रभाव के somatosensory प्रांतस्था में फोकल फैशन, हमारे इन विट्रो के साथ संगत परिणाम4. यह हमारे धुंधला और mTBI चूहों की इमेजिंग केवल एक यांत्रिक प्रभाव के दौरान vivo के समय में चूक इमेजिंग के प्रदर्शन के बाद से न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन की एक तस्वीर शॉट प्रदान करते हैं कि ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है अभी भी संभव नहीं है.
इस द्रव-puffing प्रणाली हमें न केवल अद्वितीय यांत्रिक तनाव प्रेरित varicosity गठन के साथ जुड़े सुविधाओं पर कब्जा करने की अनुमति दी है, लेकिन यह भी अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण करने के लिए । विभिंन extracellular समाधान, ब्लॉकर्स और mechanosensitive आयन चैनलों के विभिंन उंमीदवारों के सलामी बल्लेबाजों का परीक्षण करके, और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, हम पहचान की है कि क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार वी सदस्य 4 (TRPV4) चैनल है कि Ca के लिए पारगंय है2 + और ना+ और puffing द्वारा सक्रिय axonal varicosity गठन4के दौरान प्रारंभिक यांत्रिक तनाव का पता लगाने के लिए मुख्य रूप से जिंमेदार है । यह आगे एक सिरना नॉकआउट दृष्टिकोण के साथ की पुष्टि की थी । एक साथ लिया, इस नए परख प्रणाली हम हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृति के साथ विकसित की है, केंद्रीय ंयूरॉंस के micromechanical गुणों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक मूल्यवान है, विशेष रूप से अंय तकनीकों के साथ संयोजन में ।
इस micromechanical प्रणाली हम स्थापित किया है अद्वितीय है और कई प्रमुख पहलुओं में पहले से मौजूद प्रणालियों से अलग है । सबसे पहले, इस प्रणाली में, न्यूरॉन्स संपीड़न और बाल काटना के रूपों में विमान यांत्रिक तनाव से बाहर का अनुभव. यांत्रिक प्रभाव के दौरान, न्यूरॉन प्रक्रियाओं coverslip सतह से जुड़े रहते हैं और कदम नहीं है. यह अंय प्रयोगात्मक प्रणालियों से अलग है कि मुख्य रूप से झुकने और में विमान खींच (या तनाव), उदाहरण के लिए, चलती तार की तरह बंडल axons के झुकाव5,6 या खींच axons पर हो micropatterned चैनल और स्ट्रेची झिल्ली7,8. इसके अलावा, हालांकि axonal varicosities भी हमारे द्रव-puffing प्रणाली में की तरह इन परख में प्रेरित किया जा सकता है, इन सेटिंग्स में इस प्रक्रिया में अधिक समय लगता है (से 10 मिनट के लिए कई घंटे6,7,8) और प्रकट होता है अपरिवर्तनीय. अंत में, हमारी प्रणाली स्थानीय द्रव puffing का उपयोग varicosity गठन की स्थानिक सुविधाओं की परीक्षा की अनुमति देता है (उदा, dendrites, वृक्ष spins, सोमा, axonal प्रारंभिक क्षेत्रों, axonal टर्मिनलों), इसके लौकिक सुविधाओं के अलावा । इस प्रणाली का प्रयोग, हम axonal varicosity गठन, विशेष रूप से तेजी से शुरुआत, धीमी गति से reversibility, और axon-dendrite ध्रुवीयता के कई अप्रत्याशित और अनूठी विशेषताओं की खोज की ।
प्रणाली है कि हम इस पत्र में चर्चा आणविक और कोशिका जीवविज्ञान की कई तकनीकों के साथ संगत है । उदाहरण के लिए, यांत्रिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए न्यूरॉन आकृति विज्ञान और समारोह पर, यह myelin coculture के साथ इस्तेमाल किया जा सकता, फ्लोरोसेंट अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) के समय चूक इमेजिंग, कैल्शियम इमेजिंग, और पैच दबाना रिकॉर्डिंग । इस पत्र में, हम प्रणाली के मुख्य घटकों पर ध्यान केंद्रित । हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृति, द्रव-puffing सेटअप, उच्च संकल्प समय चूक axonal परिवहन के लिए इमेजिंग, और कैल्शियम इमेजिंग कदम-दर-कदम नीचे सचित्र हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस microbiomechanical परख की प्रक्रिया सीधे आगे है । यह विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन होगा, अगर सभी अपने कदम ध्यान से किया जाता है । वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि, अगर अनुचित तरीके से प्रदर्शन किया, सफल डेटा संग्रह में ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सभी पशु प्रयोग स्वास्थ्य पशु उपयोग दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया है । यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01NS093073 और R21AA024873) सी. गुजरात से अनुदान द्वारा हिस्से में समर्थन किया गया था ।
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
