Ett Microbiomechanical System för att studera Praparat bildandet och återhämtning i centrala Neuron axoner
Summary
Det här protokollet beskriver en fysiologiskt relevanta, trycksatt vätske strategi för snabb och vändbar induktion av varicosities i nervceller.
Abstract
Axonal varicosities är utvidgade strukturer längs axlarna av axoner med en hög grad av heterogenitet. De finns i hjärnor med neurodegenerativa sjukdomar eller skador, men också i den normala hjärnan. Här beskriver vi ett nyinrättade mikromekaniska system för att snabbt, tillförlitligt och reversibelt inducera axonal varicosities, tillåter oss att förstå de mekanismer som styr Praparat bildandet och heterogena protein sammansättning. Detta system utgör en roman innebär att utvärdera effekterna av komprimering och shear stress på olika subcellulär fack av nervceller, skiljer sig från andra in vitro- system som främst fokuserar på effekten av stretching. Allt på grund av de unika funktionerna i vårt system gjort vi nyligen en roman upptäckten visar att tillämpningen av trycksatta vätskan kan snabbt och reversibelt inducera axonal varicosities genom aktivering av en övergående receptor potentiell kanal. Vårt biomekaniska system kan utnyttjas praktiskt i kombination med drogen perfusion, levande cell imaging, kalcium imaging och patch clamp inspelning. Denna metod kan därför antas för att studera mechanosensitive jonkanaler, axonal transport förordning, axonal cytoskelettet dynamics, calcium signalering och morfologiska förändringar relaterade till traumatisk hjärnskada.
Introduction
Praparat bildandet eller svullnad/beading, längs axoner, är ett framträdande inslag i neurodegeneration observerats i många sjukdomar eller skador i centrala nervsystemet, inklusive multipel skleros, Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, och traumatiska hjärnan skada1,2. Trots de betydande fysiologiska konsekvenserna av axonal varicosities på aktionspotentialens spridning och synaptisk transmission3fortfarande hur varicosities genereras okänd. Nyligen hittade med en nyinrättade microbiomechanical analys på odlade Hippocampus nervceller från gnagare, vi att mekaniska stimuli kan orsaka varicosities i dessa nervceller med mycket spännande funktioner. Först Praparat induktion är snabb (< 10 s) och denna process är oväntat reversibel. Det andra Praparat inledande beror på styrkan pustande tryck: ju högre tryck, desto snabbare inledandet. Det tredje beror Praparat inledande på neuronal ålder. Axoner av yngre nervceller visas mer lyhörda mot mekanisk stress, jämfört med de äldre nervceller. Fjärde, varicosities form längs axoner av hippocampus nervceller, medan dendriter och inledande axon segment av dessa nervceller visar ingen förändring på samma tuffande villkor. Vår studie visade således ett nytt inslag av neuronala polaritet. Dessa fynd med in vitro- system är fysiologiskt relevanta. Använda en in-vivo -modell för mild traumatisk hjärnskada (mTBI), visade vi att axonal varicosities utvecklas i en multi fokal mode i somatosensoriska cortex av mössen omedelbart efter close-skalle effekt, överensstämmer med vår in vitro- resultat4. Det är viktigt att notera att våra färgning och bildbehandling av mTBI möss ger bara ett snap shot av neuronala morfologiska förändringar, sedan utför i vivo time-lapse avbildning av neuronala morfologi under en mekanisk påverkan är ännu inte är möjligt.
Denna vätska-pustande system tillät oss inte bara att fånga unika funktioner i samband med mekanisk stressinducerade Praparat bildandet, men också att fastställa bakomliggande mekanism. Genom att testa olika extracellulära lösningar, blockerare och konservöppnare olika kandidater av mechanosensitive jonkanaler och cellulär elektrofysiologi, identifierat vi att transient receptor potential cationen kanal underfamilj V medlem 4 (TRPV4) kanal som är genomsläppliga för Ca2 + och Na+ och aktiveras av pustande ansvarar huvudsakligen för att upptäcka inledande mekanisk stress under axonal Praparat bildandet4. Detta bekräftades ytterligare med siRNA knockout tillvägagångssätt. Sammantaget skapar detta nya test system har vi utvecklat med Hippocampus neuron kultur, är mycket värdefulla för att studera egenskaperna mikromekaniska av centrala nervceller, särskilt i kombination med andra tekniker.
Detta mikromekaniska system har vi etablerat är unikt och skiljer sig från de tidigare befintliga system i flera viktiga aspekter. Först i detta system uppleva nervceller out-av-plane mekanisk stress i form av komprimering och klippning. Under den mekaniska stötar, neuronala processer sitta kvar på täckglas ytan och flytta inte. Detta skiljer sig från andra experimentella system som främst handlat om böjning och i-plane stretching (eller spänning), exempelvis omläggning av medföljande axoner som flytta strängar5,6 eller stretching axoner som odlas på micropatterned kanaler och töjbart membran7,8. Dessutom även om axonal varicosities kan också induceras i dessa analyser som i våra vätska-pustande system, processen i dessa inställningar tar mycket mer tid (från 10 min till flera timmar6,7,8) och visas irreversibel. Slutligen, vårt system som använder lokala vätska pustande gör granskningen av rumsliga funktioner i Praparat bildandet (t.ex., Dendritutskotten, axonal initiala segment, soma, dendriter, axonal terminaler), förutom dess temporal funktioner. Med detta system, upptäckte vi flera oväntade och unika funktioner av axonal Praparat bildande, särskilt snabbt insättande, långsam reversibilitet och axon-dendrite polaritet.
Det system som vi diskuterar i denna uppsats är kompatibel med många tekniker av molekylära och cellbiologi. Exempelvis för att studera effekterna av mekanisk stress på neuronal morfologi och funktion, kan det användas tillsammans med myelin coculture, time-lapse avbildning av fluorescerande resonans energiöverföringen (bandet) och Totalreflexion fluorescens (Frida), kalcium imaging och patch clamp inspelning. I detta papper fokuserar vi på de centrala delarna av systemet. Hippocampus neuron kultur, vätska-pustande setup, högupplösta time-lapse imaging för axonal transport och kalcium imaging är illustrerade steg för steg nedan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förfarandet i denna microbiomechanical analys är rakt fram. Det kommer att producera tillförlitliga resultat, om alla dess steg utförs noggrant. I området i närheten finns det flera viktiga steg som, om felaktigt utfört, hindrar framgångsrik datainsamling. De kritiska steg börja uppströms i den faktiska tillämpningen av pustande stimulans. Noggrann dissektion, odling och vård av den primära neuron kulturen är avgörande. Om de odlade nervcellerna inte är friska, reagerar de inte konsekvent, eftersom de sku…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alla djurförsök har utförts i enlighet med de nationella institut för hälsa djur Använd riktlinjerna. Detta arbete stöds delvis av anslag från National Institutes of Health (R01NS093073 och R21AA024873) till C. Gu.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
