쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

Summary

침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

Abstract

Sjögren의 증후군, 전 분 비에 영향을 미치는 면역 질환 환자는 침 샘 염증을 개발 하 고 타 액 생산을 감소 했습니다. 마찬가지로 타 액 생산 머리와 목 암에 대 한 방사선 치료를 받은 환자에서 심각 하 게 손상 됩니다. 설치류 모델, 이러한 임상 조건 모방 개발 질병 pathogenesis의 이해를 촉진 하 고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 허용. 따라서, 정확 하 게, reproducibly, 그리고 반복적으로 동물 모델에서 침 샘 기능을 측정 하는 능력은 중요 합니다. 문학에서 설명한 이전 절차에 건물, 메서드는 이러한 기준을 충족 하 고 쥐에 있는 침 샘 기능을 평가 하는 데 사용 했다 개발 되었다. 이 새로운 방법의 추가적인 이점은 그것 쉽게 마스터 하 고는 작은 간 연산자 변화입니다. 침 샘 기능 (무게 또는 양) 또는 pilocarpine 자극에 대 한 응답에서 생산 하는 타 액의 속도 (mL/min)로 평가 됩니다. 수집 된 타 액 단백질 콘텐츠, 면역 글로불린 농도, 및 다른 생체 분석에 대 한 좋은 소스입니다.

Introduction

침 샘 침 다양 한 신경 및 기계적 자극¹에 대 한 응답을 생성합니다. 자극에 선 아드레날린 및 해 수용 체 교감 및 부 교감 신경 신경 시스템을 통해 수행 됩니다. Pilocarpine muscarinic 수용 체에 우위 하 게 작동 해, 파라 sympathomimetic 에이전트입니다. 침 샘에 그것은¹M3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체에 행동에 의해 타 액의 생산을 유도합니다. Pilocarpine 관리에 따라 타 액 생산 자극에 응답 하는 침 샘의 능력의 지표 이며 침 샘 기능의 측정으로 상용 된다.

타 액 생산의 정확한 측정은 Sjögren의 증후군² 등 방사선 상해 다음 머리와 목 암 치료³침 샘 질환의 연구에 중요 합니다. 여러 가지 다른 방법은 설치류에 타 액 생산을 측정 하기 위해 개발 되었습니다. ⁴배설 침 덕트, 진공⁵, 아래 구강에서 타 액의 수집 그리고 유리 모 세관⁶ 또는 micropipette^7,8, 를 사용 하 여 컬렉션의 직접적인 cannulation 포함 됩니다. ⁹. 직접 cannulation 침 덕트의 가장 정확 하 고 순수한 타 액을 제공 합니다. 그러나, 이것은 기술적으로 도전적인 절차, 그리고 ductal 상해를 일으키는 원인이 되기를 위한 잠재력 같은 동물에서 반복적인 침 컬렉션 걸로 하겠습니다. 진공에서 타 액을 수집 튜브에서 타 액의 건조 변수 결과 발생할 수 있습니다. 이 감소는 감소 된 타 액 분 비와 쥐에 더 과장 된다. 그러나 유리 모 세관 후속 분석을 위해 타 액의 컬렉션, 병에 걸린 상태에서 분 비 하는 타 액의 점도 변화는 모 세관의 효율적인 충전을 방지 하는. 또한, 잔여 타 액을 수집 구강 청소 하려고 부상으로 이어질 수 있습니다. 피펫으로 메서드는, 완전 한 컬렉션에 대 한 수 있습니다 하 고 같은 연산자에 대 한 그것은 눈에 띄게 실험 사이. 그러나, 알 수 없는 이유로이 방법은 다른 연산자 사이의 중요 한 변화를 보여줍니다. 따라서, 적절 한 비교를 허용 하려면 동일한 연산자는 특정 프로젝트와 관련 된 모든 실험을 수행 필수적 된다. 명확 하 게,이 실험실을 위한 중요 한 불리를 나타냅니다.

이러한 문제를 해결 하려면 프로시저 결합 타 액 수집 방법 인간과 설치류에 대 한 사용 개발 되었다. Pilocarpine 유도 침 볼륨 측정에 대 한 아래 설명 하는 면봉 방법을 간단 하 고, 재현성, 연산자에 의해 영향을 받지 이며 같은 동물에 반복적으로 수행할 수 있습니다. 또한, 단백질, 면역 글로불린, 또는 다른 생체의 후속 분석을 위해 타 액을 수집 하는 수 있습니다.

Protocol

아래에 설명 된 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 그것은 건강의 국가 학회에 의해 설립 하는 윤리적인 지침을 따릅니다. 이 보고서에 제공 된 모든 데이터는 10-12 주 나이의 여성 쥐를 사용 하 여 생성 되었습니다. 쥐의 다음 긴장 사용 했다: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S, 및 (B6XA/J) F1. 모든 마우스 장에 장벽 (5 동물 케이지 당) 특정 병원 체 자유로운 조건에서 지 내게 되?…

Representative Results

실험 마우스 모델 시스템에서 응답 pilocarpine 자극으로 타 액을 생산 하는 능력은 침 샘 기능의 지표로 서 사용 됩니다. 타 액 생산 면봉 메서드에서 11 주 된 C57BL/6 여성 쥐에서 측정 했다. 그림 1A, 결과 타 액 (mg) 수집된 pilocarpine의 증가 복용량을 다음의 금액으로 표시 됩니다. 체중 1 mg/kg의 복용량에 쥐의 일부 (무의식적인 떨고 고 떨고) 조 난 전시 시?…

Discussion

타 액 생산은 복잡 한 프로세스 이며 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 실험실 동물에 침 샘 기능을 측정 하는 것은 도전 될 수 있습니다. 추가 도전 침 샘 기능 같은 동물에서의 반복된 측정은 질병의 발병을 설정 하거나 복구 치료 다음과 설명 필요입니다.

이 보고서에 설명 된 면봉 메서드는 데이터를 표현 하기 위해 여러 옵션을 수행할 수 기술적으로 간단 하다. ?…

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	B21410	Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Mix solution			Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine)	Med-Vet International, Mettawa, IL, USA	RXANASED-20	Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline	Vet One, Boise, Idaho, USA	501032	Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)	Henry Schien, Dublin, OH, USA	48272	Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab	Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA	N/A	Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes	VWR, Radnor, PA, USA	89004-364	Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-290	Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	324702
18 gauge regular bevel needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	305195
Sterile scalpel blade #11	Integra York Inc PA, USA	4-311
Microdissecting forceps	Roboz, Gaithersburg, MD, USA	RS-5139	Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA	sc-224487
3 channel timer	Amazon.com, Seattle, WA, USA	B06W2KCYVN
Analytical Balance	Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS	Invivogen, San Deigo, CA, USA	tlrl-b5lps	Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant	Thermo Scientific	77161	Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum	Generated in lab		Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit	Molecular Probes, Eugene, OR, USA	E-22013	Used as per manufacturer's instructions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	0106-01	Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-01	Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-05	Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	555214	Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates	Thermo Scientific, Rochester, NY, USA	3855
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad, Hercules, CA, USA	5000006	For protein estimation as per manufacturer's instructions