部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Summary

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome の公平な定量化を紹介ここでは、定量的化学のアシル化の安定同位体標識無水物を使用しています。機密性の高いデータに依存しない取得質量分析法と組み合わせて、正確なサイト占有率測定が得られます。

Abstract

N_Ɛ– アシル化による蛋白質のリジン残基の翻訳後修飾 (PTM) は、たとえば、酵素活性を変更したり、または相互作用を仲介することによって動的にタンパク質機能を調節することができます構造の変化を誘導します。部位特異的タンパク質アシル化占有または化学量論の正確な定量化はグローバル低レベル化学量論および特定リジンの個々 の高度なアシル化の化学量論の機能的な結果を理解するため残基。他のグループは内因性、自然豊富なアシル化からペプチド前駆体の同位体の比率を比較することによりリジンのアセチル化化学量論組成の測定を報告しているし、外因性、重い同位体標識のアシル化導入後定量安定同位体標識無水酢酸を使用して蛋白質の化学アセチル化。このプロトコルを含む、いくつかの改善をした最適化アプローチを記述する: (1) アセチル化、に加えてタンパク質サクシニル化を測定する能力 (2) 化学的アシル化効率を増加した、(3) による定量精度の向上前駆物質イオン信号集録データ依存型 (DDA) からではなくデータに依存しない買収 (DIA) からのフラグメント イオンの定量化を使用して減らされた干渉。定量化のためのフラグメント イオンから抽出されたピークエリアの使用も一意に前駆イオンを使用して可能ではない 1 つ以上のリジン残基を含むタンパク質のペプチドからサイト レベルのアシル化の化学量論の分化を可能にします。定量化のための信号。スカイライン、オープン ソース定量的プロテオミクス環境では、データの可視化は、便利なデータ検査とレビューします。一緒に、このワークフローには、サイト固有のリジンのアセチル化およびサクシニル化の占有率を明らかにすることがあります、アシル化の生物学的関連性の高いサイトを優先、全体の proteome の公平な正確なそして正確な定量化が提供しています。

Introduction

N_Ɛ– 蛋白質のリジン残基のアシル化は、タンパク質の機能の重要なレギュレータです。リジンのアセチル化およびサクシニル化、malonylation、glutarylation などの他の acylations は他の細胞プロセス^1,2,の^{3,4、細胞のシグナル伝達、代謝を調節すると考えられています。}、代謝性疾患⁵の含意があるとします。数多くの研究発見したリジン アシル変更の哺乳類ティッシュの異なった条件の下で大規模な倍変化、セルの行^5,6,7,8と同様細菌^9,10,11, しかし、これらの相対的なフォールドの変更を提供しません変更総蛋白質の割合への洞察力。アシル化サイト占有率の測定は、不足している^12,13,14, 関連性にもかかわらず相対倍より詳細な情報を提供するようにこのような研究に必要な研究を変更します。たとえば、10 倍変更は、0.01 から 0.1%、1 に 10% 以上も 10 ~ 100% にサイト占有率増加を表すことができます。正確な組成比の測定が必要なは、アシル化の生物学的意義を解釈し、構造解析、タンパク質の大きさに関する影響を予測して、場合によっては、機能の変更。

1 つ前サイト占有率を定量化する手法は未変更のリジン残基と比較して外因性、内因性の「光」アセチル化間の比率を測定する質量分析法によるその後の重い安定同位体化学標識化学というラベルの付いた「重い」アセチル リジン前駆イオン強度¹²を使用しています。周らによる別の最近の調査。¹³説明もすべて変更されていないリジン残基蛋白質の完全な化学のアセチル化を用いた安定同位体標識がフラグメント イオン強度で測定された使用しているリジンのアセチル化化学量論を評価するために同様のアプローチDDA。中安ら。¹⁴は同様の DDA アプローチを使用が、代わりに定量化のため光と重いアセチル リジン導かれるインモニウム イオンの比率を使用します。フラグメント イオンに基づく定量化処理そのままペプチド前駆物質イオン (MS1) と比較して少ない信号干渉のほとんどの場合結果に導かれるインモニウムまたはシーケンスのイオン (MS2)。ただし、DDA による MS/MS スペクトルからのフラグメント イオンの定量化が高い豊富な前駆物質イオンを MS/MS を選択し、したがって、偏りのあり、不完全なサンプリングにつながる可能性が高い確率的サンプリング法の欠陥に苦しむことができます前駆物質イオン。

この斬新なワークフロー⁴ (図 1) を概念的には安定同位体の化学的ラベル付け手法バエサらによって開発された使用します。¹²ワークフローは両方の前駆体を収集するために DIA と相まってその後ただし、複数のフラグメント イオン魚鱗検出質量範囲^15,16正確な化学量論計算を提供します。

ピーク面積からフラグメント イオン、関心のアシル化サイトが含まれているまたはアシル化サイト占有率 (図 2) を定量化する使用 ‘フラグメント イオンを区別する’。変更が含まれていないフラグメント イオンは同じ光と重い m/z 値を持つ、ペプチッド識別ではなく、定量化に使用されます。スカイライン ソフトウェア¹⁷を使用して前駆体とフラグメント ピーク面積を抽出します。与えられたアシル化サイトを含む複数のフラグメント イオンの存在は、いくつかのフラグメント イオンの干渉が検出された場合に柔軟性を提供します。スカイラインでデータの可視化は、軽-重フラグメント イオン比の重要な検査が可能です。DIA を通じて収集された前駆物質イオンとフラグメント イオンのデータを使用し、定量化マニュアル データ分析に加えて社内、StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR) で作成されたオープン ソースの R パッケージが開発されました。化学量論を部位特異的アシル化ペプチド前駆物質イオン専用強度測定⁴では不可能な機能複数のリジン残基が含まれているから。

このプロトコルはまた endoproteinase、後者は多くの場合、非常に大規模な生成、ふくらむ可能性があるトリプシンまたは Arg C プロテアーゼを使用する代わりに、グルタミン酸とアスパラギン酸残基の C 末端胸の谷間のために特定である Glu C の使用方法を示しますアシル化蛋白質分解ペプチッドのアシル化リジン残基でブロックされているトリプシン分裂に起因。化学分類のプロシージャまたサクシニル化化学量論サクシニル化の定量化が可能となる無水コハク酸 (図 1) を使用する拡張されました。オフライン、基本的な pH によるペプチド分画の実装サンプル準備の強化に加えてさらにペプチドの逆相 (bRP) 分離減少定量化干渉のより良いデコンボリューションを許可します。アシル化化学量論性全体プロテオーム サンプル。一緒に、このメソッドの機能し、ハイライトのいくつかの利点:; 化学アシル化の効率化 (1)(アセチル化; に加えてタンパク質サクシニル化組成の測定 2)正確さ向上の定量化 (3)。向上の定量化は、bRP によるオフライン ペプチド事前分別の実装と同様に、DDA 前駆体信号と比較して径からのフラグメント イオン信号の減少の干渉によるものです。

Protocol

1. 定量的従って同位体標識を使用してビスグリシネートかな蛋白質および/または酢酸または無水コハク酸 並行して、1 μ g/μ L (100 μ L の合計) の濃度でのウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質のサンプルの 100 μ g 3 複製を準備尿素と triethylammonium の重炭酸塩 (TEAB) ソリューション (8 M 尿素、200 mM TEAB、pH 8) を使用して。注: アミン フリー バッファーを使用することが重要です。BSA、定量的サクシニル化 BSA であり、混合物とサンプルその BSA を降伏の定義サクシニル化占有率 0%、1%、10%、50%、100% でそれぞれ代表の結果セクションでここで使用される蛋白質のサンプル (各サンプルの準備で 3 レプリケートします)。このプロトコルは大腸菌由来タンパク質溶解液の使用も行われて、マウス肝4。プロトコルは、他の細胞や組織の溶解液にも適用できます。 ジチオトレイトール 250 mM 20 mM DTT の最終濃度に到達し、1,400 rpm で攪拌と 37 ° C, 30 分でサンプルをインキュベート (DTT) の 8 μ L で BSA サンプル (100 μ g) を 100 μ l 添加を減らします。 アルキレート 40 mM ヨードアセトアミドの最終濃度に到達し、室温で 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートする 200 mM ヨードアセトアミド 21.6 μ L で低下した BSA サンプル。注意: 重要ですヨードアセトアミド濃度を少し持っているすべてはタンパク質チオールを減少できるように DTT 濃度よりも 2 倍、アルキル化します。 無水酢酸 -d6 (ステップ 1.4.1) またはコハク酸無水物-d4 (ステップ 1.4.2) 化学 (定量的) アセチル化またはサンプルのサクシニル化に必要な準備を進めます。 分子量 (108.13 g/mol) と密度 (1.143 g/mL 25 ° c) から水性酢酸無水 -d6ソリューションの 1 g 因数のモル濃度 (M) を決定します。注: 1 g パッケージには、無水酢酸 -d6サンプルのアセチル化あたりの使用 10.57 M 溶液を降伏 875 の μ L のボリュームの 9,248 µmol が含まれています。 試薬の加水分解を避けるためにすぐに反応する前に無水 DMSO の粉末を溶解することによりコハク酸無水物-d4の 5 M 溶液を準備します。コハク酸無水-d4 5 M 解を得るため無水 DMSO の 461 μ L の 0.24 g を溶解します。 それぞれ、無水酢酸 -d6 (10.57 M 溶液 6 μ L) またはコハク酸無水物-d4 (5 M 溶液 12 μ L) 60 µmol を追加することによって定量的な化学アセチル化やサクシニル化を実行し、孵化させなさい、渦のミキサー上で 20 分間の 4 ° C でのサンプルです。注: 無水物の酸性タンパク質が沈殿させます。メモを取る、1.6 の手順で説明されているように調整します。 〜 8 O アシル化側の製品を排除するために pH を高めるため孵化後 7.25 M NaOH の 10 μ L を追加します。簡単に渦と ph 試験紙でスポッティング 1 μ L でサンプルの pH をチェック。注: 場合によっては、pH 8 に到達する 7.25 M NaOH の以上 10 μ L を追加する必要があります。さらに、潜在的に沈殿したタンパク質は再解散すべきです。 3 回の合計は 1.5 と 1.6 あたりアシル化と pH 調整手順を繰り返します。PH 値をチェックし、基本的なソリューションを繰り返しあたりに追加のボリュームに注意してください。上記の間に素早く作業化学アシル化の手順、無水物が加水分解反応性を失うので。 ラベリングの反応と pH の調整の最終的な後 O アシル化側の反応を元に戻す 50% ヒドロキシルアミン溶液 10 μ L を追加します。 2. ダイジェスト反応 Glu C Endoproteinase を使用して蛋白質のサンプル 0.8 M 50 ミリメートル TEAB、pH 8 を使用する尿素の濃度を希釈し、サンプル ボリュームを正規化します。 1:50 で endoproteinase Glu C を追加することによって蛋白質のサンプルを消化プロテアーゼの基質タンパク質比 (w/w) 1,400 rpm で攪拌と 37 ° C で一晩サンプルをインキュベートし、。 酸性化し、ボリュームによって 1% ギ酸を加えることによって蛋白質の消化サンプルを消します。 親水親油バランス固相抽出カートリッジを使用してサンプルの塩分を除きます。サンプルでは、最大 5 mg 当りカートリッジ4,18あたり 30 mg 吸着剤カートリッジを 1 個を使用します。注: この脱塩プロセス全体濡れているカートリッジ内の吸着剤を維持することが重要です。必要なときは、溶媒またはカートリッジを通して試料の通過を遅く真空ポンプをオフに。 24 ポートのガラス ブロックの真空マニホールドのポートにカートリッジを挿入し、真空ポンプをオンにします。未使用ポートのキャップを残します。1 つまたは 2 つのポートは非必要に応じて真空ゲージの低圧を維持するためにキャップのままにします。 2 倍の 80% アセトニ トリル (ACN)/0.2% ギ acid/19.8% 水 800 μ L で各カートリッジを濡れています。溶剤レベルは 2-3 mm 上吸着剤のレベルのままを確認します。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。 水の 0.2% ギ酸の 800 μ L で 3 回各カートリッジを平衡します。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。 カートリッジにペプチドのサンプルをロードします。マニホールドの真空ゲージを読み取り 6.77-なる 847万 kPa (Hg の 2-2.5)、流量が 1 mL/分を超えないことを確認します。 3 回水の 800 μ L 0.2% ギ酸と各カートリッジを洗ってください。マニホールドの真空ゲージを読み取り 16.9-67.7 kPa (5-20 Hg で) を確認します。 真空マニホールドからカートリッジを取り外し、1.5 mL マイクロ チューブに落ち着きます。 80 n/0.2% ギ acid/19.8% 水の 800 μ L で 1 回ペプチドを溶出しと孵化する溶媒剤 2-3 分。 カートリッジ内部の吸着層を介したプッシュ溶媒にピペットを使用します。同じ 1.5 mL マイクロ チューブに ACN/0.2% ギ acid/19.8% 水を 400 μ L 80% の 2 番目の溶出について繰り返します。 3 h の通常 (268 × gで遠心分離率を固定)、真空遠心で溶出液を乾燥します。注: 必要な場合は、乾燥した溶出液のサンプルは分別を続行する準備ができるまで、-20 ° C で凍結を格納できます。 3. オフライン基本 pH 逆相高速液体クロマトグラフィーを用いるペプチドを分別します。 再バッファー A の 200 μ L (水、pH 10 で 10 mM ギ酸アンモニウム) のアシル化あたりと Glu C 消化サンプル (セクション 1 と 2 で説明されているように準備) を中断、4 ° C で渦のミキサー上で 10 分間サンプルをミックス ルームで 10 分間 17,500 x gで遠心分離機テmperature。注: 結果ペプチド サンプルはオフラインにする準備ができて高 pH 分離19、20分画しました。 計測器とソフトウェアの使用によってオフライン hplc 分画をプログラムします。次のメソッドは、デュアル波長の紫外線検出器、オートサンプラー、一部コレクター許容 pH 10 C18 カラム (4.6 mm x 250 mm、5 μ m 粒子径) などバイナリ HPLC ポンプ システムの特定です。 分数あたり 2.1 分 40 分数を収集し、最終的な 4 つのプールされた分数4の結果すべての 4 番目の分数を組み合わせます。プールされた分数の大きい数は、さらに質量分析データの収集時間を犠牲にしてのサンプルの複雑さを軽減する使用ことができます。 エアカーテンでプールされた分数を乾燥、50% 水の ACN と 1% ギ酸の 1 mL に再乾燥ペプチド試料を中断、小さいサンプル容器に移します。真空の遠心分離 (268 × gで遠心分離率を固定)、1 h の通常を介して転送されたサンプルを乾燥させます。注: ギ酸アンモニウムの低蒸気圧、完全乾燥困難。乾燥後の塩の沈殿物としてギ酸酢酸アンモニウム塩のかなりの量が残っている場合は、固相抽出を繰り返します。 再インデックスの保持時間 (iRT) ペプチド標準混合物と水の 0.2% ギ酸の 20 μ L のサンプルを中断します。注: サンプルは、質量分析法による分析の準備が整いました。 4 分別されたペプチド試料の DIA 分析 利用可能な質量分析機器によると調整することができます DIA LC ・ MS/MS メソッドを使用してサンプルを分析します。直交四重極飛行時間 (QqTOF) 質量にオンライン接続されているナノ LC 2 D の高速液体クロマトグラフィー システムを使用して分析を行った。 ペプチド混合物は C18 プレカラム チップに転送されますので、機器のソフトウェアをプログラム (6 mm C18 CL チップ、3 μ m × 200 μ m 300 Å) と脱塩読み込み溶媒 (H2O/0.1% ギ酸) と 10 分のため 2 μ L/分で洗浄。 75 μ m x 15 cm C18 CL チップに至ったペプチドを分離 (3 μ m、300 Å) 300 nL/min 2 h グラデーション使用して典型的な (そして LC システム固有) の流量で水溶液と ACN 溶剤バッファー4。 (400 1,250m/z ) の全質量の範囲で段階の衝突のセルに、可変幅 (5 に 90 m/z) の質量範囲 windows が第 1 四半期極から渡される変数ウィンドウ DIA メソッドを生成します。注: 3.2 のサイクル タイム s には 64 散布幅セグメント21,22の各 45 ms 蓄積時間が続く 250 ms 前駆物質イオン スキャンが含まれています。 DDA MS による試料の並列解析とスペクトル ライブラリの建物を使用してペプチドを識別またはペプチドを PIQED ソフトウェア23、データ処理のすべての技術的な手順を処理するを使用して、DIA データから直接識別できる代わりに、識別情報、および後続の定量化のためのスカイラインにインポートします。 5. 例データ解析チュートリアル スカイライン ソフトウェア (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) をダウンロードし、PanoramaWeb アカウント (https://panoramaweb.org) を作成します。注: データとスカイラインの使用を記述する詳細なチュートリアル、(https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials) をご覧ください。その他のソフトウェアのアルゴリズムは、DIA の買収は、オープン散布24PeakView25Spectronaut26に帯状 2.0 プラグインなどから光と重いフラグメント イオン ピーク面積を抽出する代わりに使用可能性があります。 パノラマ公開からサクシニル化 BSA 代表結果 (図 3) のスカイライン データ ファイルをダウンロード: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url。パノラマ web ページ「MS 実行のターゲット」テーブルに移動し右側、あるダウンロード リンクをクリックする sky.zip ファイルをダウンロードします。ダウンロードした zip フォルダーを抽出し、スカイラインで開くに skyline.sky ファイルをダブルクリックします。ペプチド フラグメント イオン ターゲット ツリー (左側のパネル) と光サクシニル化 (右側パネル) の定義された割合から 4 つのクロマト グラムをチェックしてください。 移動し、「表示」メニューを選択”ピーク面積 |「比較ををレプリケートします。バー グラフを含む「ピーク領域-レプリケート比較」パネルは、ウィンドウ右側に表示されます。ピーク面積のパネルで右クリックし、選択”遷移 |シングル”、選択したフラグメント イオンのフラグメント イオン ピーク領域を示しています。最後に、「ピーク面積」パネルを右クリックし、「順序 |ドキュメント”。 ウィンドウの左側にあるターゲット ツリー ・ パネルで右クリック ペプチド”E.LCKVASLRE。T |比 |Oneheavy」、軽/重重イ オン信号を光イオン信号の比を計算します。注: これはありません Light/(Heavy+Light) のサイト占有化学量論比と同じです。 ターゲット ツリーが、光のフラグメント イオンの右側に、比 L/H を今報告することに注意してください。 興味のあるアシル化サイトを含む「分化フラグメント イオン」を決定します。注:図 3に示すとおり、この正確な例では、特徴差別化イオンを求めた y7 (最高位), y8b3b4と。差別フラグメント イオンがターゲット ツリーで 1 の割合を示すことに注意してください。 左側のパネルのターゲット ツリーの [588.30 + + ペプチド E.LCKVASLRE のサブ ノード。T、フラグメント イオンを差別化、y7 をクリックK [y7 ]-902.49 + (rank1) [5]増加のピーク高さと面積に注意してください。 左側のパネルのターゲット ツリーの [588.30 + + ペプチド E.LCKVASLRE のサブ ノード。T、y5を差別化するフラグメント イオンをクリックして[y5 ]-575.31 + (ランク 6) [1]。Y5フラグメント イオンのクロマト グラムとピーク面積がすべてのサンプルの同じ範囲に残ることを確認します。 ターゲット ツリー ・ パネルでその他を参照 (1 以外の比) を区別し、非差別化 (1 の割合) フラグメント イオンと変化、バー グラフとクロマト グラムのピーク面積のパターンに注意してください。 (詳細はまたマイヤーらを見るために化学量論を計算するために差別化イオンの光と重いペアに対する正確なピーク面積を決定します。4). をクリックして、「表示 |ドキュメント グリッド”と文書のグリッド線が表示されます。上のドキュメント グリッドの左クリックして”ビュー |結果を移行”ペプチッド シーケンス、前駆体 mz など、フラグメント イオンの情報を複数列テーブルを参照してくださいに複製名等 「ピボット」再び文書グリッドの「ビュー」をクリックし、ビューの編集ウィンドウを開く「編集ビュー」を選択するレポートの書式を変更します。「表示のカスタマイズ」ウィンドウの左下の「ピボット複製名」を確認し、、ビューの編集ウィンドウ閉じるには「Ok」を選択します。「ドキュメント グリッド: 移行結果」テーブル ウィンドウは、グループ名の複製、保存期間、エリア、背景に再配置されている、今、ピーク ランク列で複製を観察 (1%, 10%, 50%, 100% サクシニル化)。 ペプチド”E.LCKVASLRE。T”「ドキュメント グリッド: 移行結果」テーブルでは、”前駆体 Mz”列、「フラグメント イオン」列および 1pct_light_sw1 地区 (1% サクシニル化) 列を見つけます。(最初の 8 行で 588.30 の前駆体 Mz)、このペプチドは、光の 2 つの前駆物質イオンと重い (最後の 8 行に 590.32 の前駆体 Mz) があることを確認します。 「フラグメント イオン」列で軽くて重い前駆イオンに対応する y8 フラグメント イオンの 2 つ行を見つけます。1pct_light_sw1 領域の列の同じ行でから光 (15,820) と重 (1,426,461) の y8 領域を記録します。 サクシニル化化学量論、これらのピーク面積値を使用して計算や割合変更されると、次の式によると、0.01、または定義されているこの光サクシニル化の割合に一致する 1% サクシニル化の化学量論比を取得混合物: 144,953 (光) と 1,188,041 (重い)、0.10、または 10% サクシニル化の比率を取得する 10pct_light_sw1 エリア列から y8 差別化フラグメント イオンのピーク面積値を使用して 10% サクシニル化の化学量論比を計算します。 100% サクシニル化 y8 差別化フラグメント イオン ピーク面積値 100pct_light_sw1 エリア列、954,513 (光) と比 0.98、または 98% サクシニル化を取得する 16,407 (重い) からを使用しての化学量論比を計算します。 同様に、1% サクシニル化 55,697 (光) と 3,149,119 (重い)、0.01、または 1% サクシニル化の比率を取得する 1pct_light_sw1 エリア列から b3 差別化フラグメント イオンのピーク面積値を使用しての化学量論比を計算します。 すべての差別化フラグメント イオンの公式を使って化学量論比計算を続ける y と b の両方のイオンは、リジン サクシニル化 1、10、50、および 100% のサクシニル化混合物の化学量論組成値を取得します。

Representative Results

データ集録後差別化 MS2 フラグメント イオンを蛋白分解のアシル化ペプチドから求めた、スカイラインと対応する光で処理された後で展開されるイオンのクロマト グラム (XIC)、重いピーク面積であったが輸出されました。最後にサイト占有率を計算するため使用されます。図 2 aは、前駆イオン XIC ことができる方法の概念図を示しています、光と重いペプチドの信号の両方を備えた表示され、対応するフラグメントの例を示します図 2 bで、色分けによるイオン団長は、ヨーロッパ (赤青い光 = = 重) リジン アシル化変更を含むフラグメント イオンを区別します。 図 3は、軽/重サクシニル化 1、10、50、または 100% およびサクシニル化占有又は微量で社内に生成された BSA の事前に定義された比率に着目し上記のように稼働実験、結果はデータを示します。スカイラインに DIA 稼働データをインポートするペプチド配列と (図 3 a) 光と重い前駆イオン フラグメント イオンを表示するターゲット ツリーを簡単に表示できます。各定義済みサクシニル化 BSA 比の DIA MS からデータ immanently 軽-重 y7イオン、識別されたペプチド スペクトルの一致から最高位の差別化フラグメント イオンの比率の相対的な違いを明らかにした (赤で示されている図 3B)。ここでプレ サクシニル化 BSA から成る入力蛋白質のサクシニル化パーセントの占有率を確認した MS2 占有率計算から処理の結果の概要を図 4に示します。商業前サクシニル化 BSA、(例えば0、1、10、50、および 100% で) 定義された割合でサクシニル化から得られる 20 の蛋白質分解サクシニル化ペプチドの測定されたリジン サクシニル化占有は表 2のとおりです。各 20 の蛋白質分解 BSA ペプチド、最高ランクに格付け、MS2 を区別するフラグメント イオンは % で L/(L+H) としてリジン サクシニル化 (Ksucc) の占有率を計算する使用されました。全体的にみて、MS2 ベースの定量化は、低い結果でもアシル化占有率を決定する上で非常に良い精度を示した。 図 1: 化学量論ワークフロー 。(A) タンパク質は無水酢酸 -d6従って未変更のリジン残基と 3 回を孵化させます。次に、アセチル化蛋白質は endoproteinase Glu C、basic pH 逆相クロマトグラフィーを使用して蛋白質分解ペプチドの高速液体クロマトグラフィー分画が続くと消化されます。LCMS によるペプチドを分析する最後に、ダイヤを用いた可変前駆体の窓の幅。(B) 同じワークフローは、コハク酸無水物 -d4重いアシル化試薬を除く (A) で説明したように、サクシニル化の化学量論組成を変更を確認するためです。マイヤーらから適応の図。4 (j. アメリカ, 質量分析、オープンな選択)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 取得可能なデータの例および化学量論計算します。(A) ライト (L) と 1 つのリジンのアセチル化が異なる 3 質量の単位を含む重い (H) MS1 前駆体イオン。団長は、ヨーロッパがそれぞれ赤と青で示された光と重い同位体エンベロープ生成されます。DIA 買収からのフラグメント イオン団長は、ヨーロッパは、’差別化’ アセチル化サイトを含む光と重いフラグメント イオンを使用して実行できる MS2 から (B) の定量化は、赤と青で示されます。一般的なフラグメント イオンは、黒の点線で表示され、変更のサイトが含まれていません。マイヤーらから適応の図。4 (j. アメリカ, 質量分析、オープンな選択)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 異なるレベルでサクシニル化蛋白分解の BSA のペプチドのスカイライン可視化。(A) スカイライン ターゲット ツリーでの蛋白質分解ペプチッドを表示 LCKsuccVASLRE、その結果フラグメント イオン。(B) スカイラインは、サクシニル化占有のさまざまなレベルでのフラグメント イオンのクロマト グラムを抽出しました。最高ランクの差別化イオン、y7は 1、10、50、および 100% (社内生成) 前サクシニル化 BSA の入力割合に相関ピーク領域を増加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 前サクシニル化 BSA の BSA アシル化化学量論を評価します。重い変更の定義された率で 5 種類の BSA サンプル (e.g。 0、1、10、50、および 100% で、) MS2 入居の決定を受けた。軽い修正 (例えば0、1、10、50、および 100% で) の定義された率で 5 種類の BSA サンプルの最高ランク差別化フラグメント イオンから 20 サクシニル化 BSA ペプチドのサイト占有率を求めた.ボックス ウィスカのプロットが表示されます 20 サクシニル ペプチドの分布、ペプチドの 50% の値は、’ボックス’ (75% の百分位数は 25% 位)、上限のひげ 75% の百分位の値が最大 (100%) に表し、下限のひげ25% パーセン タイルから最小 (0% 位) までの値。(J. アメリカ, 質量分析等オープンな選択)。表 2に、測定の定量化を見つけることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 時間 (分) % A % B 0.00 100 0 7.27 92 8 45.27 73 27 49.27 69 31 65.27 61 39 72.27 40 60 80.00 10 90 85.00 10 90 86.00 100 0 120.00 100 0 流量: 0.7 mL/分 水で pH 10 ギ酸アンモニウム バッファー a: 10 mM 90 n と 10% 水で pH 10 ギ酸アンモニウム バッファー b: 10 mM 注意: 両方の移動相の pH ときちんとしたアンモニア 10 に調整 表 1: オフライン基本 pH 逆相 HPLC 分画のグラデーションします。グラデーションの長さ: 水、pH 10 でギ酸アンモニウム 120 分バッファー a: 10 mM。バッファー b: 10 mM アンモニウム ギ酸 90 n と 10% が水、pH 10。 L/L + H % L/L + H % L/L + H % L/L + H % L/L + H % Ksucc 0% Ksucc 1% Ksucc 10% Ksucc 50% Ksucc 100% 0.2 1.7 11.1 50.9 99.2 1.2 2.3 12.3 49.4 97.6 2.9 3.8 14 48.6 99.5 0.5 1.8 11.7 50.8 99.5 0.2 1.7 11.1 48.3 98.2 0.2 1.2 11 47.5 96.1 0.3 1.6 12.8 51 99.2 3.7 5.2 14.7 51.9 89.5 1.5 1.8 12.5 47.2 91.1 0.8 1.5 11.3 48.4 96.8 0.2 1.6 13.9 49.7 98.9 0.1 1.1 10.7 48.2 98.6 0.2 0.9 10.3 49.4 99.4 0.5 2.5 17.2 52.3 97.5 0.1 3.5 20.8 51 99 0.3 1.9 10.7 49.6 98.2 2 1.7 10.9 47.7 96.3 0.3 1.2 10 53 98 1.1 1.8 12.9 57.9 94.1 0.2 1.4 11.6 48.6 98.8 表 2: 20 の蛋白質分解サクシニル化ペプチドの測定された BSA リジン サクシニル化占有の定量化します。サクシニル化ペプチド商業前サクシニル化 BSA、(例えば0、1、10、50、および 100% で) 定義された割合でサクシニル化から得られます。各 20 の蛋白質分解 BSA ペプチド、最高ランクに格付け、MS2 を区別するフラグメント イオンは % で L/(L+H) としてリジン サクシニル化 (Ksucc) の占有率を計算する使用されました。

Discussion

このプロトコルは、小説とサイト固有のリジンのアセチル化と全体プロテオームに適用できるサクシニル化占有を定量化する正確な方法を提供します。このメソッドは、内因性光ペプチドと生成された体外タンパク質の化学的アシル化定量を用いた重水素化酢酸無水-d₆うち後者は、外因性の重いペプチドの測定に依存していますかコハク酸無水物-d₄ (図 1)。同様のメソッド ネイティブ未変更のリジン残基の安定同位体標識を使用し、いずれか前駆物質イオン専用¹²またはフラグメント イオン DDA 買収^13,14からに基づいたサイト占有率の定量化を行います。このプロトコルはアシル化効率を改善するために試料中にいくつかの手順を適用し、サクシニル化する化学標識化を拡張します。DIA 買収を使用して、データ コレクションを取得前駆イオンと MS2 フラグメント イオン強度フラグメント イオンの干渉を減らす全体の検出可能な質量範囲にします。分析・ スカイライン ・自社開発のカスタム スクリプト経由で数量化含む 1 つ以上のリジン残基と 1 つのサイトで 1 つ以上のアシル化ペプチドのサイト占有率計算を許可します。

サンプル準備段階で密接に従う必要がありますこのプロトコルのいくつかの重要な手順があります。全体のプロトコルは、すべてのリジン残基の効率的な化学修飾に依存しているので、この手順は非常に重要です。ライセートの蛋白質アミンを含むバッファーまたは汚染物質分子を避けなければならないので、無水物は遊離アミンと反応します。また化学あたりアシル化段階では、反応混合物の pH が調整されて pH 8 に戻る各無水試薬と 3 つ孵化の後この反応混合物の酸性し、O アシル化副反応を形成可能性がありますを確認します。さらに、8 M 尿素を含む反応混合物に周りが最適な範囲内に pH を消化してチェック前に 0.8 M 尿素の希釈は Glu C. endoproteinase の最適な活動のために重要プロトコルの主要なコンポーネントはデータ収集ステップと DDA データ サンプリング不整合を克服、MS2 のフラグメント イオンのレベルで定量化が可能、DIA ワークフローの導入。DIA 手法の主な利点の 1 つは、通常はるかに傾向がある、問題があるとき (以前の出版物のいくつかを示唆している)、MS1 前駆イオン信号の干渉の減少です。

非常に複雑なサンプルを準備する際、ワークフローにいくつかの変更を行うことが。中に使用する分数も LC さんさらに、クロマトグラフィーによるグラデーションになったことによって取得がプールされたサンプルの複雑さを低減するオフライン基本 pH 逆相 HPLC 分画を小さくした後にプールの数ペプチドのよりよい分離を可能にする買収。また、裂かれたペプチッドのより大きい変化を生成し、タンパク質のリジン残基のカバレッジを高めるのためのサンプルを消化する複数のプロテアーゼを使用する可能性があります。試運転と最適化は、アセチル化またはサクシニル化の特定の割合を含む商業の BSA を使用して実施できます。

この議定書の 1 つの制限は、メチル化、ユビキチン化など、同じサイト⁴などの他のリジン変更を行方不明ため可能性のあるわずかなサイト占有率の過大評価です。光と重いアシル変更、L/(L+H) のピーク面積から計算サイト占有率はリジン サイトでの変更の合計レベルが ‘光’ アシル化のみ内因性 (L) で構成されているという仮定に基づいて、化学的に「重い」というラベルの付いたアシル化 (H)。しかし、サイト体内における実際合計アシル化占有率はアセチル化および/またはサクシニル化を超えてその他の変更を含めることができます。さらに、購入した試薬無水酢酸 –d₆ (99%) とコハク酸無水物-d₄の報告された同位体純度 (> 98%) を 2% (サクシニル) または 1% (アセチル) の小さな過大評価に貢献するかもしれない、内因性アシル化レベル⁴。一緒に、これらのわずかな過大評価を加える難易度 1% 未満でサイトの定量化における占有率。大きい豊富の完全な違い化学的にアシル化ペプチドとネイティブのアシル化ペプチドにも、潜在的なサイト占有数量誤りで、特に低内因性アシル化ペプチド²⁷。Weinertらによる最近の研究。²⁷発見完了あたりアセチル化ペプチドの減らされた豊富な違いが定量化エラー²⁷を減らすことができます。

このプロトコルを使用して収集した化学量論数量は、生物学的フォロー アップ実験、関心のある特定のサイトのサイト指示された突然変異誘発のための特定蛋白質およびフォーム仮説に重要なアシル化のホット スポットを特定することが。このプロトコルは、タンパク質の構造安定性に間接または微妙な影響を及ぼす可能性がありますし、携帯電話環境をローカライズ低アシル化化学量論サイトの併用効果を明らかにすることも。さらに、アセチル化およびサクシニル化、アセチル化を超えてその他の可能なリジン アシル化の変更を測定するこの議定書の実施が別の下で蛋白質の動的アシル化効果洞察を提供一意に生物学的条件。

Materials

aqueous acetic anhydride-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1% isotopic purity
succinic anhydride-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	2% isotopic purity
sequencing grade endoproteinase Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma)	10791156001	1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt)
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT 094225
HPLC acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
HPLC grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
iodoacetamide	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
FLUKA formic acid (FA) for mass spec	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~98%
urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
bovine serum albumin (BSA)	Pierce, Rockford, IL, USA	88341
triethylammonium bicarbonate (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
sodium hydroxide (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
50% hydroxylamine solution in water	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
LC-MS grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Waters 1525 binary HPLC pump system	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 column	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	model# 845
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per quote
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per quote
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Sw-3001
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001