部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome の公平な定量化を紹介ここでは、定量的化学のアシル化の安定同位体標識無水物を使用しています。機密性の高いデータに依存しない取得質量分析法と組み合わせて、正確なサイト占有率測定が得られます。
NƐ– アシル化による蛋白質のリジン残基の翻訳後修飾 (PTM) は、たとえば、酵素活性を変更したり、または相互作用を仲介することによって動的にタンパク質機能を調節することができます構造の変化を誘導します。部位特異的タンパク質アシル化占有または化学量論の正確な定量化はグローバル低レベル化学量論および特定リジンの個々 の高度なアシル化の化学量論の機能的な結果を理解するため残基。他のグループは内因性、自然豊富なアシル化からペプチド前駆体の同位体の比率を比較することによりリジンのアセチル化化学量論組成の測定を報告しているし、外因性、重い同位体標識のアシル化導入後定量安定同位体標識無水酢酸を使用して蛋白質の化学アセチル化。このプロトコルを含む、いくつかの改善をした最適化アプローチを記述する: (1) アセチル化、に加えてタンパク質サクシニル化を測定する能力 (2) 化学的アシル化効率を増加した、(3) による定量精度の向上前駆物質イオン信号集録データ依存型 (DDA) からではなくデータに依存しない買収 (DIA) からのフラグメント イオンの定量化を使用して減らされた干渉。定量化のためのフラグメント イオンから抽出されたピークエリアの使用も一意に前駆イオンを使用して可能ではない 1 つ以上のリジン残基を含むタンパク質のペプチドからサイト レベルのアシル化の化学量論の分化を可能にします。定量化のための信号。スカイライン、オープン ソース定量的プロテオミクス環境では、データの可視化は、便利なデータ検査とレビューします。一緒に、このワークフローには、サイト固有のリジンのアセチル化およびサクシニル化の占有率を明らかにすることがあります、アシル化の生物学的関連性の高いサイトを優先、全体の proteome の公平な正確なそして正確な定量化が提供しています。
NƐ– 蛋白質のリジン残基のアシル化は、タンパク質の機能の重要なレギュレータです。リジンのアセチル化およびサクシニル化、malonylation、glutarylation などの他の acylations は他の細胞プロセス1,2,の3,4、細胞のシグナル伝達、代謝を調節すると考えられています。、代謝性疾患5の含意があるとします。数多くの研究発見したリジン アシル変更の哺乳類ティッシュの異なった条件の下で大規模な倍変化、セルの行5,6,7,8と同様細菌9,10,11, しかし、これらの相対的なフォールドの変更を提供しません変更総蛋白質の割合への洞察力。アシル化サイト占有率の測定は、不足している12,13,14, 関連性にもかかわらず相対倍より詳細な情報を提供するようにこのような研究に必要な研究を変更します。たとえば、10 倍変更は、0.01 から 0.1%、1 に 10% 以上も 10 ~ 100% にサイト占有率増加を表すことができます。正確な組成比の測定が必要なは、アシル化の生物学的意義を解釈し、構造解析、タンパク質の大きさに関する影響を予測して、場合によっては、機能の変更。
1 つ前サイト占有率を定量化する手法は未変更のリジン残基と比較して外因性、内因性の「光」アセチル化間の比率を測定する質量分析法によるその後の重い安定同位体化学標識化学というラベルの付いた「重い」アセチル リジン前駆イオン強度12を使用しています。周らによる別の最近の調査。13説明もすべて変更されていないリジン残基蛋白質の完全な化学のアセチル化を用いた安定同位体標識がフラグメント イオン強度で測定された使用しているリジンのアセチル化化学量論を評価するために同様のアプローチDDA。中安ら。14は同様の DDA アプローチを使用が、代わりに定量化のため光と重いアセチル リジン導かれるインモニウム イオンの比率を使用します。フラグメント イオンに基づく定量化処理そのままペプチド前駆物質イオン (MS1) と比較して少ない信号干渉のほとんどの場合結果に導かれるインモニウムまたはシーケンスのイオン (MS2)。ただし、DDA による MS/MS スペクトルからのフラグメント イオンの定量化が高い豊富な前駆物質イオンを MS/MS を選択し、したがって、偏りのあり、不完全なサンプリングにつながる可能性が高い確率的サンプリング法の欠陥に苦しむことができます前駆物質イオン。
この斬新なワークフロー4 (図 1) を概念的には安定同位体の化学的ラベル付け手法バエサらによって開発された使用します。12ワークフローは両方の前駆体を収集するために DIA と相まってその後ただし、複数のフラグメント イオン魚鱗検出質量範囲15,16正確な化学量論計算を提供します。
ピーク面積からフラグメント イオン、関心のアシル化サイトが含まれているまたはアシル化サイト占有率 (図 2) を定量化する使用 ‘フラグメント イオンを区別する’。変更が含まれていないフラグメント イオンは同じ光と重い m/z 値を持つ、ペプチッド識別ではなく、定量化に使用されます。スカイライン ソフトウェア17を使用して前駆体とフラグメント ピーク面積を抽出します。与えられたアシル化サイトを含む複数のフラグメント イオンの存在は、いくつかのフラグメント イオンの干渉が検出された場合に柔軟性を提供します。スカイラインでデータの可視化は、軽-重フラグメント イオン比の重要な検査が可能です。DIA を通じて収集された前駆物質イオンとフラグメント イオンのデータを使用し、定量化マニュアル データ分析に加えて社内、StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR) で作成されたオープン ソースの R パッケージが開発されました。化学量論を部位特異的アシル化ペプチド前駆物質イオン専用強度測定4では不可能な機能複数のリジン残基が含まれているから。
このプロトコルはまた endoproteinase、後者は多くの場合、非常に大規模な生成、ふくらむ可能性があるトリプシンまたは Arg C プロテアーゼを使用する代わりに、グルタミン酸とアスパラギン酸残基の C 末端胸の谷間のために特定である Glu C の使用方法を示しますアシル化蛋白質分解ペプチッドのアシル化リジン残基でブロックされているトリプシン分裂に起因。化学分類のプロシージャまたサクシニル化化学量論サクシニル化の定量化が可能となる無水コハク酸 (図 1) を使用する拡張されました。オフライン、基本的な pH によるペプチド分画の実装サンプル準備の強化に加えてさらにペプチドの逆相 (bRP) 分離減少定量化干渉のより良いデコンボリューションを許可します。アシル化化学量論性全体プロテオーム サンプル。一緒に、このメソッドの機能し、ハイライトのいくつかの利点:; 化学アシル化の効率化 (1)(アセチル化; に加えてタンパク質サクシニル化組成の測定 2)正確さ向上の定量化 (3)。向上の定量化は、bRP によるオフライン ペプチド事前分別の実装と同様に、DDA 前駆体信号と比較して径からのフラグメント イオン信号の減少の干渉によるものです。
このプロトコルは、小説とサイト固有のリジンのアセチル化と全体プロテオームに適用できるサクシニル化占有を定量化する正確な方法を提供します。このメソッドは、内因性光ペプチドと生成された体外タンパク質の化学的アシル化定量を用いた重水素化酢酸無水-d6うち後者は、外因性の重いペプチドの測定に依存していますかコハク酸無水物-d4 (図 1)。同様のメソッド ネイティブ未変更のリジン残基の安定同位体標識を使用し、いずれか前駆物質イオン専用12またはフラグメント イオン DDA 買収13,14からに基づいたサイト占有率の定量化を行います。このプロトコルはアシル化効率を改善するために試料中にいくつかの手順を適用し、サクシニル化する化学標識化を拡張します。DIA 買収を使用して、データ コレクションを取得前駆イオンと MS2 フラグメント イオン強度フラグメント イオンの干渉を減らす全体の検出可能な質量範囲にします。分析・ スカイライン ・自社開発のカスタム スクリプト経由で数量化含む 1 つ以上のリジン残基と 1 つのサイトで 1 つ以上のアシル化ペプチドのサイト占有率計算を許可します。
サンプル準備段階で密接に従う必要がありますこのプロトコルのいくつかの重要な手順があります。全体のプロトコルは、すべてのリジン残基の効率的な化学修飾に依存しているので、この手順は非常に重要です。ライセートの蛋白質アミンを含むバッファーまたは汚染物質分子を避けなければならないので、無水物は遊離アミンと反応します。また化学あたりアシル化段階では、反応混合物の pH が調整されて pH 8 に戻る各無水試薬と 3 つ孵化の後この反応混合物の酸性し、O アシル化副反応を形成可能性がありますを確認します。さらに、8 M 尿素を含む反応混合物に周りが最適な範囲内に pH を消化してチェック前に 0.8 M 尿素の希釈は Glu C. endoproteinase の最適な活動のために重要プロトコルの主要なコンポーネントはデータ収集ステップと DDA データ サンプリング不整合を克服、MS2 のフラグメント イオンのレベルで定量化が可能、DIA ワークフローの導入。DIA 手法の主な利点の 1 つは、通常はるかに傾向がある、問題があるとき (以前の出版物のいくつかを示唆している)、MS1 前駆イオン信号の干渉の減少です。
非常に複雑なサンプルを準備する際、ワークフローにいくつかの変更を行うことが。中に使用する分数も LC さんさらに、クロマトグラフィーによるグラデーションになったことによって取得がプールされたサンプルの複雑さを低減するオフライン基本 pH 逆相 HPLC 分画を小さくした後にプールの数ペプチドのよりよい分離を可能にする買収。また、裂かれたペプチッドのより大きい変化を生成し、タンパク質のリジン残基のカバレッジを高めるのためのサンプルを消化する複数のプロテアーゼを使用する可能性があります。試運転と最適化は、アセチル化またはサクシニル化の特定の割合を含む商業の BSA を使用して実施できます。
この議定書の 1 つの制限は、メチル化、ユビキチン化など、同じサイト4などの他のリジン変更を行方不明ため可能性のあるわずかなサイト占有率の過大評価です。光と重いアシル変更、L/(L+H) のピーク面積から計算サイト占有率はリジン サイトでの変更の合計レベルが ‘光’ アシル化のみ内因性 (L) で構成されているという仮定に基づいて、化学的に「重い」というラベルの付いたアシル化 (H)。しかし、サイト体内における実際合計アシル化占有率はアセチル化および/またはサクシニル化を超えてその他の変更を含めることができます。さらに、購入した試薬無水酢酸 –d6 (99%) とコハク酸無水物-d4の報告された同位体純度 (> 98%) を 2% (サクシニル) または 1% (アセチル) の小さな過大評価に貢献するかもしれない、内因性アシル化レベル4。一緒に、これらのわずかな過大評価を加える難易度 1% 未満でサイトの定量化における占有率。大きい豊富の完全な違い化学的にアシル化ペプチドとネイティブのアシル化ペプチドにも、潜在的なサイト占有数量誤りで、特に低内因性アシル化ペプチド27。Weinertらによる最近の研究。27発見完了あたりアセチル化ペプチドの減らされた豊富な違いが定量化エラー27を減らすことができます。
このプロトコルを使用して収集した化学量論数量は、生物学的フォロー アップ実験、関心のある特定のサイトのサイト指示された突然変異誘発のための特定蛋白質およびフォーム仮説に重要なアシル化のホット スポットを特定することが。このプロトコルは、タンパク質の構造安定性に間接または微妙な影響を及ぼす可能性がありますし、携帯電話環境をローカライズ低アシル化化学量論サイトの併用効果を明らかにすることも。さらに、アセチル化およびサクシニル化、アセチル化を超えてその他の可能なリジン アシル化の変更を測定するこの議定書の実施が別の下で蛋白質の動的アシル化効果洞察を提供一意に生物学的条件。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIH 国立研究所糖尿病によって支えられたし、消化器・腎臓疾患 NIH の NIDDK 付与 R24 DK085610 (PI: E. バードン)。JGM NIH T32 交わりに支えられ (T32 AG000266、PI: J. campisi さん)。著者は NIH からのサポート共有バック所 TripleTOF 6600 システム計装グラント認める (1S10 OD016281、PI: マリンスイーツ ギブソン)。
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |