Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)
Summary
Formazione immagine di ultrasuono ad alta frequenza del mouse fetale ha migliorato imaging ad alta risoluzione e può fornire precisa caratterizzazione non invasiva di sviluppo cardiaco e difetti strutturali. Il protocollo descritto nel presente documento è stato progettato per eseguire ecocardiografia fetale in tempo reale di topi in vivo.
Abstract
Difetti congeniti del cuore (CHDs) sono la causa più comune di infanzia morbilità e mortalità precoce. Rilevazione prenatale i meccanismi molecolari di CHDs è cruciale per inventare nuove strategie preventive e terapeutiche. Modelli di topo mutante sono strumenti potenti per scoprire nuovi meccanismi e modificatori di stress ambientale che guidano lo sviluppo cardiaco e loro potenziale alterazione in CHDs. Tuttavia, gli sforzi per stabilire la causalità di questi presunti collaboratori sono stati limitati a studi istologici e molecolari negli esperimenti sugli animali non-sopravvivenza, nel quale monitoraggio di parametri fisiologici ed emodinamici chiave sono spesso assenti. Tecnologia di imaging dal vivo è diventata uno strumento essenziale per stabilire l’eziologia di CHDs. In particolare, l’imaging ad ultrasuoni può essere utilizzato prenatally senza esporre chirurgicamente i feti, che permette di mantenere la loro fisiologia di base durante il monitoraggio dell’impatto dello stress ambientale sugli aspetti strutturali ed emodinamici della camera cardiaca sviluppo. Nel presente documento, utilizziamo il sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30/45) per esaminare il sistema cardiovascolare in topi fetali al E18.5 nell’utero alla linea di base ed in risposta all’esposizione prenatale ipossia. Dimostriamo la fattibilità del sistema per misurare dimensioni camera cardiaca, morfologia, funzione ventricolare, frequenza cardiaca fetale e indici di flusso dell’arteria ombelicale e loro alterazioni fetali topi esposti ad ipossia cronica sistemica nell’utero in tempo reale tempo.
Introduction
Malformazioni congenite del cuore sono eterogenei difetti strutturali che si verificano durante lo sviluppo cardiaco iniziale. Gli avanzamenti tecnici correnti delle procedure operative hanno condotto ai miglioramenti significativi nei tassi di sopravvivenza dei neonati con CHDs1,2. Tuttavia, la qualità della vita è spesso compromessa secondaria alle esigenze e l’ospedalizzazione prolungata per in scena riparazione chirurgica procedure1,2,3,4,5. Rilevazione prenatale i meccanismi molecolari di CHDs è cruciale al fine di pianificare gli interventi precoci, per realizzare nuove strategie di prevenzione e migliorare i risultati permanente6,7.
Anche se più fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di CHDs, stabilire la causalità rimane un bisogno insoddisfatto per migliorare il sistema diagnostico, terapeutico e strategie preventive1,8,9 ,10,11,12. Inoltre, esaminando il ruolo di fattori di stress nell’utero e modificatori epigenetici apre nuove sedi per le indagini future11,12. Nell’ultimo decennio ha infatti visto rapidi progressi nel sequenziamento tecnologia di nuova generazione tra cui microarray di singolo nucleotide polymorphism (SNP), il sequenziamento dell’esoma intero e studi di metilazione del genoma, loro utilizzo nello studiare la genetica cause di malattie umane complesse, compreso spianando la strada per identificare mutazioni novelle e varianti genetiche che non sono ancora state CHDs1,8,9,10,11 testati per la loro patogenicità in modelli animali adatti.
Tra i sistemi di modello differenti di malattia, il mouse è il modello animale di scelta, non solo per studiare i meccanismi di CHDs durante i primi cardiogenesis13,14,15,16, ma anche per delucidare loro impatto sulla maturazione camera cardiaca e funzione a fine gestazione in fattori di stress prenatale e perinatale. Quindi, eseguendo in vivo caratterizzazione fenotipica di un cuore fetale murino, durante fasi sia precoce e tardiva di sviluppo, è fondamentale per comprendere il ruolo di queste variazioni genetiche e fattori ambientali sullo sviluppo cardiaco, e il potenziale futuro impatto sui processi di maturazione specifici di camera in topi.
Diagnosi precoce e accurata diagnosi dei difetti cardiaci durante lo sviluppo è fondamentale per interventistica pianificazione17,18. Essere sicuro, semplice, portatile e ripetibile, l’ecografia fetale è infatti diventata la norma tecnica per la valutazione cardiaca nella clinica di imaging. Valutazione di circolazione fetale usando ultrasuono di Doppler è stato ampiamente utilizzato nella pratica clinica non solo per la rilevazione di difetti cardiaci, ma anche per rilevare le anomalie vascolari, insufficienza di placenta e restrizione della crescita intrauterina e di valutare il benessere fetale in risposta agli insulti in utero tra cui ipossiemia, malattia materna e droga tossicità17,18. In parallelo al suo valore nella valutazione delle malattie e difetti umani, valutazione di ultrasuono dei mouse fetali ha guadagnato sempre maggiore utilità Impostazioni sperimentali19,20,21,22, 23. In particolare, ecografia del cuore fetale (ecocardiografia) permette la visualizzazione sequenziale in vivo del cuore in via di sviluppo. Molti studi sperimentali hanno utilizzato tecnologie di imaging ad ultrasuoni per osservare lo sviluppo cardiovascolare fetale in topi transgenici fetali. L’ultrasuono di Doppler è stato particolarmente utile per chiarire i parametri fisiopatologici, come i modelli di flusso nella circolazione fetale sotto fisiologiche sfide o malattia condizioni10,19. In entrambi gli esseri umani e animali, flusso o dell’ossigeno di sangue anormale al feto può derivare da varie condizioni che possono interferire con ambiente fetale nell’utero e influenzare l’asse fetoplacental, compreso le anomalie placentare, ipossia materna, il diabete gestazionale e costrizione vascolare farmacologicamente indotto15,22. Di conseguenza, che fissa i metodi standardizzati per l’esecuzione di ultrasuoni Doppler fetale topi tremendamente potenzieranno gli studi futuri di CHDs facilitando il monitoraggio dei flussi e indici emodinamici chiavi dei circuiti cardiovascolari durante diverse fasi di sviluppo cardiaco in modelli genetici murini.
L’ultrasuono ad alta frequenza è emerso come un potente strumento per misurare i parametri fisiologici e di sviluppo del sistema cardiovascolare in modelli murini e malattie umane18. Questa tecnologia è stata ulteriormente perfezionata negli ultimi anni. Noi ed altri ricercatori abbiamo dimostrato la fattibilità di questo sistema per lo svolgimento di studi ultrasuoni altissima frequenza sul fetali del mouse cuore15,19,20,21,22 ,23. Il sistema è dotato di tracciato di flusso di Doppler di colore e allineamento lineare trasduttori che generano immagini bidimensionali, dinamiche a frequenze di fotogrammi ad alta frequenza (da 30 a 50 MHz). Questi vantaggi, rispetto ai sistemi ad ultrasuoni a bassa frequenza e la generazione precedente di alta frequenza ultrasuoni21,22, forniscono la necessaria sensibilità e risoluzione per valutazione approfondita del fetale circolatori sistema, tra cui la completa caratterizzazione delle strutture del cuore, funzione della camera e indici di flusso dei mouse fetali nei quadri sperimentali. Qui, descriviamo i metodi per eseguire la valutazione rapida di circolazione cardiopolmonare e la circolazione feto-placentare al giorno embrionale E18.5 in vivo utilizzando un sistema ad alta frequenza. Abbiamo scelto un trasduttore di 30/45 MHz che fornisce una risoluzione assiale di circa 60 µm e una risoluzione laterale di 150 µm. Tuttavia, un trasduttore di frequenza più alto (40/50 MHz) può essere scelto per analizzare le precedenti fasi di sviluppo seguendo un simile approccio metodologico. M-modalità selezionata consente la visualizzazione dei tessuti in movimento a livelli di alta risoluzione temporale (1.000 fotogrammi/s). Infine, dimostriamo la fattibilità dell’ultrasuono alta per dettagliata completa caratterizzazione fenotipica di condizione emodinamica cardiovascolare fetale e funzione nei topi alla linea di base e nella risposta allo stress prenatale ipossia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malattie e malformazioni cardiovascolari sono sostanzialmente influenzati da fattori genetici e ambientali elementi19. Precedentemente abbiamo dimostrato un impatto significativo della restrizione calorica materna, avviata durante il secondo trimestre, il flusso circolatorio feto-placentare e funzione cardiaca fetale9.
L’ipossia prenatale è un altro fattore di stress comuni durante lo sviluppo fetale che può influenzare enormemente la fisiologi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il nucleo di fisiologia animale, divisione di medicina molecolare presso la UCLA per fornire supporto tecnico e accesso aperto al sistema Vevo 2100 ultrasuono biomicroscopy (UBM). Questo studio è stato sostenuto dal centro di ricerca di salute di NIH/bambino (5K12HD034610/K12), UCLA-bambini Discovery Institute e fondo di oggi e di domani di bambini e David Geffen School of medicina ricerca Innovation award per M. Touma.
Materials
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
References
- Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
- Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
- Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
- Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
- Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection?. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
- Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), 1245-1250 (2010).
- Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
- Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
- Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
- LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
- Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
- Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
- Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
- Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
- Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
- Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
- He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
- Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
- Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
- Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
- Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
- Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
- Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
- Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).
