عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا mast البريتوني مورين. يصف لنا أيضا بروتوكولين لتوصيف وظيفي على: تصوير فلورسنت داخل الخلايا الحرة Ca2 + تركيز ومقايسة تحبب استناداً إلى الكمي اللونية للمفرج عنهم β-هيكسوسامينيداسي.
Abstract
خلايا ماست (MCs)، كجزء من النظام المناعي، وتلعب دوراً أساسيا في الدفاع عن البلد المضيف ضد العديد من مسببات الأمراض، وفي الشروع في الاستجابة المناعية حساسية. تفعيل الإشراف عن طريق العابرة للربط من سطح فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزمة تقارب عالية ايغي مستقبلات (FcεRI)، وكذلك من خلال تحفيز مستقبلات أخرى عديدة، يبدأ صعود داخل الخلايا الحرة Ca2 + المستوى ([Ca2 +]أنا) أن يعزز الإفراج عن وسطاء التهابات وحساسية. تحديد المكونات الجزيئية المشاركة في هذه المسارات مما يشير إلى أمر حاسم لفهم تنظيم وظيفة MC. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول لعزل نوع النسيج الضام مورين MCs بالغسل البريتوني وزراعة MCs البريتوني (الشركات العسكرية الخاصة). الثقافات للإشراف من خروج المغلوب الماوس نماذج مختلفة من هذه المنهجية تمثل نهجاً مفيداً لتحديد البروتينات المشاركة في MC إشارات المسارات. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف بروتوكول لخلية مفردة Fura-2 التصوير كما أسلوب هام للتحديد الكمي ل Ca2 + إشارات في MCs. المستندة إلى الأسفار الرصد [Ca2 +]أنا موثوقة ويشيع استخدام نهج دراسة Ca2 + يشير إلى الأحداث، بما في ذلك دخول الكالسيوم تعمل بالمخزن، الذي يتسم بأهمية قصوى لتفعيل MC. لتحليل تحبب MC، يصف لنا مقايسة إصدار β-هيكسوسامينيداسي. يعتبر مبلغ β-هيكسوسامينيداسي التي تطلق في المتوسط الثقافة كعلامة تحبب لكل ثلاثة مختلفة الافرازية المجموعات الفرعية الموصوفة في الإشراف-β-هيكسوسامينيداسي يمكن بسهولة قياسها كمياً بفعلها مع الركازة كولوريجينيك في ميكروتيتير لوحة مقايسة اللونية. هذا الأسلوب استنساخه بدرجة عالية من حيث التكلفة ويتطلب أي معدات متخصصة. إجمالاً، يوضح البروتوكول قدم عالية غلة من MCs معربا عن علامات السطح MC نموذجية، عرض السمات الشكلية والمظهرية نموذجية للإشراف، وإظهار الردود استنساخه بدرجة عالية على سيكريتاجوجويس في كاليفورنيا2 +– فحوصات التصوير وتحبب.
Introduction
الإشراف دوراً بارزا خلال الاستجابات المناعية الفطرية والمكتسبة. على وجه التحديد، MCs المشاركة في قتل مسببات الأمراض، مثل البكتيريا والطفيليات، وكذلك تتحلل محتملة السمية الببتيدات الذاتية أو مكونات من السموم (لاستعراض انظر جالي et al. 20081). دور الرصد والمراقبة الفسيولوجية في الحصانة الفطرية والتكيف هو موضوع نقاش ساخن. ولذلك، تتطلب التناقضات بيانات عديدة في الدراسات التي يؤديها مع نماذج مختلفة من الماوس MC-تفتقر إلى منهجية إعادة تقييم الوظائف المناعية للإشراف تتجاوز الحساسية2. MCs ناضجة تكون مترجمة معظمها في الأنسجة والأعضاء مثل الجلد والرئة، والأمعاء، وعادة ما تكون موجودة فقط في إعداد صغيرة في الدم. الإشراف مستمدة من السلائف المكونة للدم، مثل MC فروعه، وإتمام تمايز ونضج في ميكرونفيرونمينتس تقريبا جميع الأنسجة فاسكولاريزيد1. عامل المستمدة من الخلايا T انترلوكين (إيل)-3 بشكل انتقائي يعزز الاستمرارية والانتشار، والتفريق بين سكان pluripotent الماوس MCs من فروعه المكونة للدم على3. الخلية الجذعية عامل (SCF) هي التي تنتجها الخلايا الهيكلية في الأنسجة ويلعب دوراً حاسما في التنمية مولودية، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، والدالة4. خصائص الإشراف الفردية قد تختلف تبعاً لقدرتها على تجميع وتخزين مختلف البروتياز أو بروتيوجليكانس. في الفئران، تتميز MCs ما يسمى النسيج الضام-نوع من الإشراف المخاطية وفقا للتعريب التشريحية ومورفولوجيا، والمحتوى من الهيبارين والبروتياز5.
في أنظمة الرصد والمراقبة، أي بزيادة قدرها مجاناً Ca سيتوسوليك2 + ([Ca2 +]أنا) أمر لا غنى عنه تحبب وإنتاج eicosanoids، فضلا عن توليف السيتوكينات وتفعيل عوامل النسخ ردا على مستضد و مختلف سيكريتاجوجويس6. هو المصب هدفا رئيسيا لهذه المحفزات phospholipase جيم، الذي هيدروليزيس فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي دياسيلجليسيرول (همرشولد) واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي. همرشولد ينشط البروتين كيناز ج والنشرات IP3 أيونات Ca2 + من هيولى. استنفاد هذه المحلات ينشط Ca2 + التدفق عبر غشاء البلازما Ca2 + القنوات، مما يؤدي إلى تخزين الكالسيوم تعمل دخول (سوسي). هو أثارت هذه العملية من خلال التفاعل من Ca2 +-استشعار، stromal التفاعل جزيء-1 (Stim1)، في هيولى مع Orai17 وكذلك من خلال تفعيل مستقبلات عابر المحتملة المتعارف عليه في قناة (TRPC) البروتينات (لاستعراض انظر فريتشيل et al. 8من 2014) في غشاء البلازما.
لدراسة دور الفسيولوجية لهذه القنوات، عدة الدوائية (تطبيق محصرات قنوات) أو نهج الوراثية تستخدم عادة. وفي الحالة الأخيرة، يتحقق قمع التعبير البروتين باستهداف مرناً (ضربة قاضية) أو تحرير الحمض النووي مع حذف العمومية أو الخاصة بالانسجة9 إكسون الترميز مسام تشكيل وحدة فرعية قناة (خروج المغلوب). ويقتصر توافر مانع مع خصوصية كافية لهذه القنوات. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نهج ضربة قاضية تحكم دقيق من الفعالية استخدام، على سبيل المثال-غربية لطخة تحليل، ويعوقها عدم وجود أجسام مضادة محددة للبروتين القناة المستهدفة في كثير من الحالات. وهكذا، لا يزال يعتبر استخدام نماذج الماوس خروج المغلوب كمعيار الذهب لمثل هذا التحليل. نموذج مفضل في المختبر لتحقيق مهام المؤتمر الوزاري هو زراعة الشركات العسكرية الخاصة التي يمكن أن تكون معزولة السابقين فيفو كعدد سكان ناضجة تماما (بدلاً من التمييز بين الإشراف في المختبر ، على سبيل المثال-، خلايا نخاع العظام)10 . مقارنة بنخاع العظام المستمدة MCs (بممكس)، التي تستخدم عادة لدراسة MC الدالة في المختبر، وحفز FcεRI وبيتا-هيكسوسامينيداسي الإصدار هو زيادة 8 إضعاف ومعززات في هذه الشركات، على التوالي. في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لعزل وزراعة مورين الشركات العسكرية الخاصة، التي تسمح بالحصول على بعد 2 أسابيع من استزراع عدد كبير من النسيج الضام نقي نوع الإشراف، كافية لمزيد من التحليل.
على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع وتطبيق المؤشرات الكالسيوم وراثيا المرمزة، الاستخدام الخاص بهم لا يزال محدودا بصعوبات في إيصال الجينات إلى الخلايا المستهدفة، وعلى وجه التحديد، في خلايا متخصصة للغاية–مثل الأسماك المستزرعة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، لا تزال هذه المجموعة من المؤشرات نيون [Ca2 +]أنا القياسات تفتقر إلى الأصباغ راتيوميتريك مع مجموعة ديناميكية عالية. لهذه الأسباب، الأسلوب المفضل لقياس راتيوميتريك [Ca2 +]أنا لا يزال استخدام صبغة الفلورسنت “Fura-2”11.
في الوقت الراهن، النهج الأكثر شيوعاً لتقييم تفعيل المنهج النموذجي وتحبب قياس النشاط β-هيكسوسامينيداسي. Β-هيكسوسامينيداسي، وسيط حساسية، هو أحد مكونات الحبيبية مولودية أن المفرج عنهم يشترك مع الهستامين في نسبة ثابتة من الإشراف12. ويمكن قياس β-هيكسوسامينيداسي بسهولة ودقة من خلال فعلها مع الركازة محددة، التي تنتج كمية قابلة لقياس لمنتج كولوريجينيك التي لا يمكن اكتشافها بسهولة في مقايسة اللونية ميكروسكوبية. ويقال في هذا المقال، تطبيق هذه التقنية لتحليل تحبب الشركات العسكرية الخاصة في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات.
تجميع مستقبلات عالية تقارب فريق الخبراء الحكومي الدولي بلاسماليمال (FcɛRI) ينشط في الإشراف مسار إشارات داخل الخلايا تنوعاً، مما يؤدي إلى الإفراج عن محتوى الحبيبية الافرازية في الفضاء خارج الخلية المجاورة. بالإضافة إلى مستضد معين، يمكن تنشيط العديد من المحفزات الأخرى الإشراف على الإفراج عن مجموعة متنوعة من الوسطاء إيمونومودولاتوري، مثل أنافيلاتوكسينس تكملة (مثلاً., C3a و C5a)13, endothelin الببتيد مضيق للأوعية 1 (ET1)14 ، وكذلك العديد من المواد الموجبة والمخدرات آثار ردود فعل بسيودواليرجيك (مثلاً., إيكاتيبانت)15 بالربط إلى MRGPRX216. مسارات الإشارات داخل الخلايا المشاركة في الإشراف التي يسببها مرجبر تحبب تتميز ضعيف بالمقارنة مع FcɛRI بوساطة الإشارات داخل الخلايا؛ وبدأت هذه المسارات فقط إلى دراسة مكثفة خلال السنوات القليلة الماضية17 بعد تحديد مستقبلات16. إلى حد كبير، تبقى قنوات أيون غشاء البلازما المتورطين في إدخال الكالسيوم متبوعاً MRGPRX2 التحفيز يجب أن يفهم. ولذلك، تركز هذه المادة أيضا على إشارات الكالسيوم داخل الخلايا وحفز تحبب للإشراف مع مرجبر يضع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام نماذج MC بنجاح لدراسة تحبب MC، إنزيمية، والالتصاق، فضلا عن توضيح مسارات توصيل إشارات تشارك في تفعيل المؤتمر الوزاري داخل الخلايا. بعض الباحثين استخدام نماذج MCs البشرية، مثل خطوط مخلدة (LAD2 و HMC1) أو الإشراف البشرية المستمدة من الحبل الدم الخلايا السلف (CD133 +) وخلايا الدم المحيطية ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن ينوه جمين جوليا للمساعدة التقنية في إعداد الخلية الصاري واستزراع. وأيد هذا العمل “مركز البحوث التعاونية من بين الأقاليم” (TR SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
