ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה
Summary
שיטה מוצגים כאן עבור הכנת הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) עם decellularization יעיל. TEM יכול לשמש פיגומים פונקציונלי של הבנייה מחדש של מודל קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC) לשון בתנאים סטטי או מנוער תרבות.
Abstract
על מנת לבנות מודל אפקטיבית ומציאותית עבור הלשון קשקש קרצינומה (TSCC) במבחנה, השיטות נוצרו כדי לייצר decellularized הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) אשר מספק פונקציונליות פיגומים בנייה TSCC. TEM מספק נישה במבחנה צמיחת תאים, בידול של נדידת תאים. מזערים של מטריצה חוץ-תאית מקורי (ECM) ויצירות ביוכימי בתוך המטריקס decellularized מספקים רקמות ספציפיות נישות עיגון תאים. הזיוף של TEM ניתן למימוש על ידי עיכול deoxyribonuclease (DNase) בליווי של רעלני אורגני או לא. פרוטוקול זה קלה לתפעול ומבטיחה יעילות גבוהה עבור decellularization. TEM הראה cytocompatibility חיובית עבור תאים TSCC בתנאים תרבות סטטי או מנוער, המאפשרת בניית המודל TSCC. ביוריאקטור מתוצרת עצמית שימש גם עבור התנאי מנוער מתמשך עבור תרבית תאים. TSCC שוחזר באמצעות TEM הראה את התכונות והמאפיינים הדומה histopathology TSCC קליני, מציעה את הפוטנציאל במחקר TSCC.
Introduction
הלשון יש תפקידים חשובים שונים, כגון deglutition, חיתוך, טעימות. לפיכך, ירידת ערך של פונקציה הלשון יש השפעה רבה על איכות החיים של המטופלים1. הגידול השכיח ביותר בחלל הפה הוא לשון קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC), אשר מתרחשת בדרך כלל אצל אנשים לשתות אלכוהול או לעשן טבק2.
בשנים האחרונות, הושגה התקדמות במחקר בסיסי על TSCC. היעדר מחקר יעיל במבחנה מודלים נשאר להיות אחת הבעיות הגדולות ביותר. לפיכך, מטריצות (ECM) הופך להיות פתרון אפשרי. מאז ה-ECM הוא מסגרת רשת מורכבת המורכב מטריקס מאורגן מאוד רכיבים, לגרדום חומרים שיש, מבנה דמוי ECM ו קומפוזיציה יהיה כשיר לחקר הסרטן. Decellularized ECM יכולה לספק באופן מושלם את הנישה התאים של אותו מקור במבחנה, אשר הופך להיות היתרון המשמעותי ביותר של ה-ECM.
ECM יכול להישמר עם מרכיבי התא הוסר מן הרקמות דרך decellularization באמצעות חומרי ניקוי ואנזימים. ECM רכיבים שונים, לרבות קולגן, fibronectin laminin במטריצת decellularized מספקים microenvironment דמויי רקמה מקורי של תאים בתרבית, לקדם את הישרדות, התפשטות, התמיינות של תאים3. יתר על כן, אפשר לצמצם את immunogenicity עבור השתלת ברמה מינימלית עם חסרונו של מרכיבי התא ב- ECM.
עד כה, נוסו שיטות ייצור עבור decellularized ECM ברקמות שונות ובאיברים, כגון הלב4,5,6,7, כבד8,9,10 ,11, ריאות12,13,14,15,16,17ו-18,כליות19 , 20. עם זאת, אין מחקרים רלוונטיים להיות מצאו בעבודה דומה בלשון לפי מיטב הידע שלנו.
במחקר זה, לשון decellularized מטריצה חוץ-תאית (TEM) היה מפוברק בצורה יעילה וגם בזול על ידי סדרה של פיזי, כימי, טיפול אנזימטי. ואז TEM שימשה מסכם את הדברים TSCC במבחנה, מציג סימולציה המתאים TSCC התנהגות והתפתחות. TEM יש הביו טוב, כמו גם היכולת להנחות את התאים הגומחה רקמות ספציפיות, אשר מציין כי TEM יכול להיות פוטנציאל גדול TSCC מחקר3. בפרוטוקול שמוצג כאן מספקת מבחר של החוקרים ללמוד על פתוגנזה או טיפולים קליניים של TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול ומבוססת על ייצור ECM decellularized צריך לשמור את ההרכב ECM מקורית בעת הסרת רכיבים תאית ברקמות כמעט לחלוטין21. למרות decellularization כעת מדווחת פרוטוקולים אשר דורשים זלוף דרך להערכת להסיר חומרים הסלולר בתחבורה הולכת חום, עצבנות מכני אומצה, המכונה השיטה המסורתית פשוט וזול22</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר את התמיכה של מענקי מחקר הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31371390), את תוכנית המיזם המדינה ההיי-טק פיתוח (2014AA020702), התוכנית של גואנג-דונג מדע וטכנולוגיה (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
