真菌病原体液体荧光恢复法测定脂质指数黑穗病玉米
Summary
在这里, 我们描述了一个获得脂滴指数 (LD 指数) 的协议, 以研究在高通量实验中培养的细胞中甘油三酯的动力学。LD 指数法是一种使用 BODIPY 493/503 的简便可靠的方法。这种检测不需要 dispendious 脂提取或显微分析。
Abstract
本文介绍了应用 LD 指数法测定脂滴 (LDs) 中甘油三酯 (微板块) 积累的灵敏的检测方法。获得了不带脂质提取的 LD 指数。它允许测量在不同条件下的高吞吐量实验中的 LDs 含量, 如富含或氮气耗尽介质的生长。尽管该方法首次被描述为研究酿酒酵母中的脂滴代谢, 它成功地应用于担子黑穗病玉米。有趣的是, 由于 LDs 是真核细胞 phylogenetically 保存的细胞器, 这种方法可以应用于大量的不同的干细胞, 从酵母到哺乳动物细胞。LD 指数是基于 BODIPY 493/503 在淬火条件下的液体荧光恢复试验 (LFR), 通过添加与甲醛固定的细胞.碘钾用作荧光淬火。荧光与光密度斜率的比值为 LD 指数。斜坡是计算的直线, 当 BODIPY 荧光和光学密度在 600 nm (OD600) 绘制的样本添加。最佳数据质量是由相关系数等于或高于 0.9 (r ≥ 0.9) 反映出来的。可以同时读取多个示例, 因为它可以在微板块中实现。由于 BODIPY 493/503 是一种脂溶性荧光染料, 分成脂肪滴, 它可以用于许多类型的细胞积累 LDs。
Introduction
脂滴 (LDs) 是无处不在的细胞内脂肪体组成的核心中性脂, 主要是标签和甾醇酯 (SE)。核心周围有一层磷脂, 与蛋白质如 perilipin 和酶参与合成中性脂, 如甘油酰基转移酶, 乙酰基 coa 酶和酰 coa 综合体,1。由于其动态行为, 磷脂单层还含有水解标记和 SE2的三酰甘油脂肪酶。根据细胞类型和有机体, 储存中性脂可以用来产生能量, 或合成磷脂和信号分子。在酵母和其他真菌中, LDs 的含量随培养基中氮/碳比值的变化而变化, 表明氮的可用性降低可能是提高中性脂产量的关键3,4 ,5。在酵母中生产大量的标签, 在生物技术中作为生物燃料的来源和食品工业中有潜在的用途。一些储存的脂质含有高比例的多不饱和脂肪酸, 如欧米茄3和欧米茄 6, 营养和膳食重要性6,7,8,9,10,11. 包括人类细胞在内的哺乳动物细胞的 LDs 也含有标记和胆固醇酯。磷脂单层与酵母 LDs 中描述的蛋白质的哺乳动物同源性相互作用, 另外一种蛋白质, perilipin, 在酵母12中不存在。磷脂单层及其相关蛋白的一个建议作用是稳定 lds 结构, 并允许 lds 与细胞器的相互作用, 如线粒体、内质网、过氧化物酶体和液泡, 主要用于脂交换13,14。有趣的是, 在人类中, LDs 似乎参与了2型糖尿病, 动脉粥样硬化, 脂肪性肝炎和冠心病的病理, 其中有增加的数字15,16,17.某些类型的病毒使用 LDs 作为平台来组装病毒2,18,19。
由于 lds 在人类病理中的影响及其潜在的生物技术应用, 对 lds 形成的精确实验测定是一项重要的任务。本文描述了一个可靠的检测方法的基础上恢复荧光 (LFR) 的 BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-波拉-3 a, 4 a-diaza s indacene), 以获得相对价值的中性脂在细胞中的含量。通过这种分析, 可以跟踪真菌中中性脂类积累的动态, 如U. 玉米和酿酒酵母, 还有哺乳动物细胞, 不需要脂质提取20.该方法首次在酿酒酵母中应用, 以确定参与调节脂质代谢的蛋白磷酸和激酶。这是可能的, 不用油脂提取或蛋白质纯化21,22。LFR 也被用来建立腹腔巨噬细胞的 LDs 形成的动力学23。BODIPY 493/503 的使用比其他中性脂质染料有一定的优势, 如尼罗河红色。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂质和有一个狭窄的放射频谱, 促进同时检测的信号, 如红色荧光蛋白或图面-跟踪, 当样品分析的共焦显微镜。不幸的是, BODIPY 493/503 对漂白很敏感, 但在暴露于光24中使用 antiquenching 试剂可以避免此过程。
在酵母细胞中进行 LFR 测定, 在理想的营养条件下培养, 整除数在不同时间被提取。其次, 细胞是固定的甲醛, 这保持了 LDs 的完整性数月, 当细胞存储在4摄氏度。其他固定技术应避免, 特别是使用甲醇或冷丙酮, 因为它们导致 LDs 在细胞内的退化24。为了测量 LD 指数, 甲醛固定细胞悬浮在水中, 以获得明确的浓度。然后, 它们被添加到包含荧光 BODIPY 493/503 的解决方案中, 当荧光进入细胞并与 LDs 关联时, 它的荧光就会恢复。伴随荧光测量 (485 nm/510 nm), 细胞的浓度通过测量 600 nm 的光学密度来量化。每一个样品被读四次通过增加随后5µL 整除数甲醛固定的细胞悬浮到同样井。荧光和吸光度的空白在细胞的加法之前获得。通过确定测量的线性度来评估荧光和吸光度数据的质量: 如果 r < 0.9, 数据被丢弃。r 值是重要的, 因为基本上荧光强度应该产生一个线性反应, 以增加细胞浓度。如果细胞浓度过高, 线性度就会丢失。LFR 法为高通量实验中选择所需的 LD 表型提供了一种快速、简便、经济的方法。在选择所需条件后, 可以通过共焦显微镜对单个细胞的 LD 含量进行研究, 使用与 BODIPY 染色的相同的甲醛固定细胞, 提供细胞中 LDs 的图像。用薄层色谱法进一步分析了它们的标记和硒含量。
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR 是首次应用于研究酵母中脂质代谢的新方法, 后来在U. 玉米20,21中成功实现。虽然 ld 指数并没有给出细胞中累积的标记的绝对值, 但它为细胞的脂质含量提供了一个快速的概念, 当比较两个或多个实验条件的 LD 指数时, 对数据的解释是直截了当的。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂, 主要成分的 LDs, 它有一个狭窄的发射频谱, 以促进同时检测…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 Politécnico 国立 Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864)、方案 de 支持农场 Proyectos-Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-国立大学国立墨西哥的赠款的支持 (UNAM) 和委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP 和 256520-GGS)。Fundação de 宪法保护 Pesquisa 做里约热内卢 (FAPERJ Cientistas 做 Nosso: E 26/103.353/2011)。我们感谢 QFB。奥斯卡豪尔赫·伊万·莫拉·戈多伊 Luqueño Bocardo 为示意图概述。我们感谢米格尔博士 Tapia 罗德里格斯在 LDs 的共焦显微术中的宝贵帮助。我们要感谢布鲁诺 Bozaquel Morais 博士在开发酵母技术方面的开创性工作, 我们已经适应了U. 玉米。
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
References
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
