Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno
Summary
Un protocole est présenté afin de préparer le polyvinyliques alcool-co-itaconique acides hydrogels avec raideur variable, qui ont été greffés avec et sans les oligopeptides, pour étudier l’effet de la rigidité des biomatériaux sur la différenciation et la prolifération des cellules souches. La rigidité des hydrogels était contrôlée par le temps de réticulation.
Abstract
L’effet d’indices physiques, comme la rigidité des biomatériaux sur la prolifération et la différenciation des cellules souches, a été étudié par plusieurs chercheurs. Toutefois, la plupart de ces chercheurs ont utilisé des hydrogels de polyacrylamide pour culture de cellules souches dans leurs études. Par conséquent, leurs résultats sont controversés car ces résultats pourraient provenir de la spécificité de la polyacrylamide et non à partir de la file d’attente physique (rigidité) des biomatériaux. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des hydrogels, qui ne reposent pas sur polyacrylamide, où les différentes souches, les cellules dont les cellules souches embryonnaires humaines (ES) et humaines pluripotentes induites des cellules souches (iPS), peuvent être cultivées. Hydrogels avec raideur variable ont été préparés à partir bioinert, polyvinyl alcool-co-itaconique acide (P-IA), avec raideur, contrôlé par le degré de réticulation en changeant de temps de réticulation. Les hydrogels de P-IA greffées avec et sans les oligopeptides provenant de la matrice extracellulaire a été étudiées comme une future plate-forme de la culture de cellules souches et différenciation. La culture et le passage de cellules de tige fluides amniotique, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines est décrit en détail ici. Les hydrogels oligopeptide P-IA ont montré des performances supérieures, qui ont été induits par leurs propriétés de rigidité. Ce protocole indique la synthèse de ce biomatériau, manipulation de leur surface, ainsi que de contrôler les propriétés de rigidité et enfin, leur impact sur les cellules souches sort en utilisant des conditions de culture libre xeno. Se fondant sur des études récentes, ces substrats mis à jour le peuvent agir comme des futures plateformes pour soutenir et diriger le destin de diverses cellules souches ligne à liaisons différentes ; et encore, de se régénérer et de restaurer les fonctions de l’organe perdu ou un tissu.
Introduction
Le sort de la différenciation des cellules souches dans une lignée spécifique des cellules et la prolifération à long terme des cellules souches, cellules surtout humaines pluripotentes induites (iPS) et les cellules souches embryonnaires humaines (ES), est connu pour être régulée par des inhibiteurs, facteurs de croissance, et / ou de petites molécules bioactives dans les milieux de culture. Récemment, les repères physiques des biomatériaux, particulièrement la rigidité des biomatériaux de culture cellulaire, ont été reconnues comme un facteur important, guider le destin des cellules souches la prolifération et la différenciation1,2, 3,4,5,6. Par conséquent, plusieurs chercheurs ont commencé à enquêter sur le sort des cellules souches, qui sont cultivées sur des hydrogels, sur la différenciation, principalement à l’aide de polyacrylamide hydrogels avec raideur variable.
La rigidité des biomatériaux peut contrôler des adhérences focales, la morphologie cellulaire, phénotype cellulaire et l’adhérence de cellules souches, en particulier dans la culture à deux dimensions (2d)1,2,3,5. Mécano-détection des biomatériaux par les cellules souches est généralement contrôlée par adhérence focale signalisation via intégrines. NMMIIA, myosine non musculaire contractilité IIA-dépendante du cytosquelette d’actine joue un rôle essentiel dans le processus de mechanosensing des cellules souches en 2-D cell culture systèmes3,4,5, 7,8,9,10,11.
Engler et ses collègues ont développé une notion intéressante que les cellules souches adultes, comme la moelle osseuse des cellules de tige (BMS) cultivées sur les biomatériaux de culture cellulaire avec une rigidité similaire à celle des tissus spécifiques, ont tendance à se différencier en cellules provenaient de 5de tissus spécifiques. BMS cellules incubées sur polyacrylamide doux 2D hydrogels recouverts de collagène de type I (avec une rigidité comparable à celle des tissus cérébraux) dans les médias d’expansion ont été spontanément induites à se différencier en premières lignées de neurone, tandis que BMS cellules cultivées sur hydrogels avec une rigidité similaire à celle des tissus musculaires ou osseux collagénique trouvées pour induire la différenciation en premières lignées des myocytes et les ostéoblastes, respectivement, du 2D polyacrylamide hydrogels3,5. Plusieurs chercheurs ont étudié le devenir de cellules souches de la différenciation cultivés sur polyacrylamide hydrogels immobilisées avec le collagène de type I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Toutefois, il convient de mentionner que certains contradictoires rapports1,18,22,23,24 existent pour la célèbre idée suggérée par Engler et al. 5 c’est parce qu’idée5 de Engler a été développé uniquement sur polyacrylamide hydrogels et leurs résultats provenir des caractéristiques particulières de ce biomatériau (polyacrylamide) et pas uniquement à partir de la file d’attente physique (rigidité) de ce biomatériau. Par conséquent, il est important de développer un autre type d’hydrogel, dont la rigidité peut être contrôlée par réticulation de l’hydrogel. À cette fin, les hydrogels bioinert ont été développés, qui ont été préparés de polyvinyle alcool-co-itaconique acide (P-IA) avec une rigidité différente, qui était contrôlée par le degré de réticulation avec une évolution réticulation temps25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. les cellules souches peuvent être cultivées sur ici P-IA hydrogels, ainsi que P-IA hydrogels greffés avec des matrices extracellulaires (ECMs) et oligopeptides. Dans une précédente étude25des cellules souches hématopoïétiques humaines (hHSCs) du sang de cordon ombilical ont été cultivés sur P-IA hydrogels avec des valeurs de rigidité différente allant d’un 3 kPa à 30 kPa module de stockage où la fibronectine ou un oligopeptide dérivé la fibronectine (CS1, EILDVPST) a été greffée sur les hydrogels P-IA. Haute ex vivo expansion pli de hHSCs a été observée chez les hydrogels P-IA greffées avec CS1 ou la fibronectine, qui affiche une rigidité intermédiaire allant de 12 kPa à 30 kPa25.
IPS humaines et cellules d’ES ne peut pas être cultivées sur culture de tissus classiques polystyrène (TCP) plats33,34 parce que ES humains et cellules iPS nécessitent une fixation spécifique aux SEGDA, tels que la vitronectine ou laminine pour maintenir leur pluripotence au cours de la culture à long terme. Par conséquent, plusieurs structures d’oligopeptide-greffés P-IA hydrogels présentant des caractéristiques de rigidité optimale ont été conçus et préparés dans les formations d’une seule chaîne, une chaîne unique avec un segment commun, une double chaîne avec un segment commun et un type ramifié 32de chaîne. Oligopeptide séquences ont été sélectionnés dans les domaines de liaison intégrine et glycosaminoglycanes d’ECMs. Les hydrogels P-IA greffés avec les oligopeptides dérivés de vitronectine avec une double chaîne ou un segment commun, d’un indice de stockage à environ 25 kPa, prise en charge de la culture à long terme de ES humains et de cellules iPS pour plus de 12 passages sous xeno-libre et chimique 32de conditions définies. Le segment mixte et double chaîne de molécules d’adhérence cellulaire sur les hydrogels a facilité la prolifération et la pluripotence des humains ES et iPS cellules32. Ici, un protocole pour la préparation des hydrogels P-IA (avec un module de stockage de 10 kPa à 30 kPa, ce qui a été mesurée dans des conditions humides dans l’air) greffées avec et sans les oligopeptides ou ECMs est décrite. Comment la culture et le passage de plusieurs cellules souches (y compris les cellules souches fluides amniotiques, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines) s’affiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM et P-IA-ECM hydrogels avec raideur variable ont été développées pour l’expansion à long terme de ES humain et CSPi conservant leur pluripotence pour plus de dix passages dans des conditions sans xeno, ainsi que pour la culture de cellules humaines de l’AFS, cellules d’annonces, et les cellules souches hématopoïétiques25,28,32. P-IA hydrogels immobilisées avec oligoECM sont un excellent candidat pour …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été partiellement prises en charge par le ministère de la Science et technologie, Taiwan sous concession numéros 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 et 104-2221-E-008-107-MY3. Cette recherche a été également pris en charge par le projet de l’hôpital de Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Une subvention pour la recherche scientifique (numéro 15K 06591) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon est également reconnue. A. Higuchi aimerait remercier pour le programme de partenariat scientifique International (ISPP-0062) Vice Rectorat pour les études supérieures et postdoctorales, Université du Roi Saoud, Riyadh 11451, Royaume d’Arabie saoudite.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
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