Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

Résumé

Un protocole détaillé pour effectuer un titrage ELISA est décrite. En outre, un nouvel algorithme est présenté afin d’évaluer le titrage des tests ELISA et d’obtenir une constante de dissociation de liaison d’un ligand soluble à un récepteur immobilisée plaque de microtitration.

Résumé

La constante de dissociation décrit l’interaction entre les deux partenaires dans l’équilibre de liaison et est une mesure de leur affinité. C’est un paramètre crucial pour comparer différents ligands, par exemple, des inhibiteurs compétitifs, isoformes protéiques et mutants, pour leur force de la liaison à un partenaire de liaison. Constantes de dissociation sont déterminés en fonction des concentrations de lié contre ligand libre comme les courbes de liaison. En revanche, les courbes de titration, dans lequel un signal qui est proportionnel à la concentration de ligand lié est comploté contre la concentration totale de ligand ajouté, sont beaucoup plus faciles à enregistrer. Le signal peut être détecté par spectroscopie et par dosage immunoenzymatique (ELISA). Ceci est illustré dans un protocole pour un titrage ELISA qui mesure la liaison de la rhodocetin dérivé de venin de serpent à son domaine cible immobilisé de l’intégrine α2β1. Titrage des tests ELISA sont polyvalents et largement utilisé. N’importe quelle paire de protéines qui interagissent utilisable comme récepteur immobilisé et ligand soluble, pourvu que les deux protéines sont purs, et leurs concentrations sont connues. Jusqu'à présent, la difficulté a été de déterminer la constante de dissociation d’une courbe de titrage. Dans cette étude, une fonction mathématique qui sous-tend les courbes de titrage est introduite. Sans aucune estimation Erreurs graphique d’un rendement de saturation, cet algorithme permet le traitement des données brutes (intensité de signal à différentes concentrations du ligand ajouté) directement par l’évaluation mathématique par régression non linéaire. Ainsi, plusieurs courbes de titration peuvent être enregistrés simultanément et transformés en un ensemble de paramètres caractéristiques, dont la constante de dissociation et la concentration de liaison active du récepteur, et elles peuvent être évaluées statistiquement. Lorsqu’il est combiné avec cet algorithme, titrage ELISA bénéficier de l’avantage de présenter directement la constante de dissociation. Donc, ils peuvent être utilisés plus efficacement dans l’avenir.

Introduction

La constante de dissociation K est un paramètre clé pour décrire l’affinité d’un récepteur (R) pour son ligand (L). Se fondant sur la Loi d’action de masse, K est défini pour l’équilibre, dans lequel la RL complexe récepteur-ligand dissocie le récepteur R et le ligand l :

            Équation 1

avec les indices f indiquant l’État libre/non consolidé de récepteurs et ligands. La concentration du complexe récepteur-ligand, RL, est identique à la concentration de ligand lié aux récepteu....

Protocole

1. stocks Solutions

1. Pour préparer 100 mL de 10 x TBS solution pH 7,4, dissoudre 6,06 g de TRIS et 8,77 g de NaCl dans 90 mL d’eau désionisée, ajuster le pH à 7,4 avec 37 % HCl solution, remplir le volume à 100 mL d’eau désionisée et filtrer la solution.
2. Préparer 100 mL de 1 M HEPES/NaOH, solution à pH 7,4, dissoudre 23,83 g de HEPES dans 90 mL d’eau désionisée, ajuster le pH à 7,4 avec 1,5 M NaOH, remplir le volume à 100 mL d’eau désionisée et filtrer la solution.
3. Pour la préparation de 100 mL de solution de NaCl à 5 M, dissoudre 29,2 g de NaCl dans 90 mL d’eau désionisée. Remplissez le volume à 100 mL d’eau désionisée et filtrer la solut....

Résultats

Après le test ELISA a été mis au point, la couleur jaune du substrat phosphatase alcaline converti, para- nitrophénolate, indique que le montant du ligand lié rhodocetin diminue avec la baisse des concentrations de rhodocetin supplémentaire de colonnes 1 à 11 (Figure 1). Les puits incolores dans les puits rhodocetin-libre, dans la colonne 12 montrent un signal de faible bruit de fond.

Quant.......

Discussion

Le titrage ELISA est un système polyvalent de test afin de déterminer la dissociation d’une interaction de récepteur-ligand. Comme le titrage ELISA contourne la nécessité de distinguer nettement les ligands libres et liées et d’analyser leurs concentrations quantitativement, sensiblement plus d’études et de publications ont employé le titrage ELISA au lieu d’enregistrer des courbes de liaison . En outre, titrage ELISA sont faciles à effectuer et ont besoin de quantités relativement basses des récepteurs et des ligands. P.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
intégrine a2A, de type sauvage et mutante, recombinante		isolée dans le laboratoire de l'auteur
Colonne NiNTA superflow	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
dosage de l'acide bicinchoninique (BCA), kit de détermination de la concentration protéique	Fisher Scientific	23225
albumine sérique bovine (BSA), fraction V	Applichem	A1391
Solution à 25 % de glutaraldéhyde	Merck	354400
anticorps anti-immunoglobuline de lapin provenant de chèvre, conjugué à la phosphatase alcaline	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Acétate de Zn(II)	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Comprimé de substrat de phosphatase alcaline (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Microplaque demi-zone	Thermo Scientific	Corning 3690
tubes de microréaction	Eppendorf	30120086
Lecteur de microplaque ELISA	BioTek	Synergy HT