성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

Summary

여기는 청각 및 vestibular 함수에 최소 손상 반원의 운하를 통해 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달 수 있는 canalostomy 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 마우스 내가 바이러스 성 벡터, 제약, 그리고 작은 분자를 접종을 사용할 수 있습니다.

Abstract

내가 치료 약물의 로컬 배달 내가 질병에 대 한 유망한 요법입니다. 사출 반원의 운하 (canalostomy)를 통해 내가 지역 약물 전달에 대 한 유용한 접근 될 표시 되었습니다. 이 문서의 목표는 설명, 세부 사항, 성인 및 신생아 쥐에 있는 canalostomy에 관련 된 수술 기법입니다. 빠른 녹색 염료 및 adeno 관련 바이러스 serotype 8 녹색 형광 단백질 유전자에 의해 표시 된,는 canalostomy vestibular 끝-기관 청력에 최소한의 손상으로 달팽이 관에 삽입 된 시 약의 광범위 한 배포를 촉진 하 고 vestibular 기능입니다. 수술은 성인과 신생아 쥐;에서 성공적으로 구현 실제로, 다 수 수술 필요한 경우 수행할 수 수 있습니다. 끝으로, canalostomy 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 약물 전달에 효과적이 고 안전한 방법 이며 미래에 인간의 내가 질병을 치료 하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

감각 청력 손실 및 영향을 vestibular 부전 환자와의 밀접 하 게 연관 된 내가 장애. 내가 치료 약물의 배달 내가 질환의 치료에 대 한 약속을 보여줍니다. 조직 또는 로컬 접근 내가 약물을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 일부 내가 질병 idiopathic 갑자기 청력 상실, 일반적으로 전신 스테로이드¹처리 등 조직의 약국 성공적으로 처리 됩니다. 또한, Lentz 외. 센스 oligonucleotide의 체계적 관리는 난청을 개선 하 고 Ush1c 돌연변이 마우스 모델²에서 기능을 균형 있게 보여주었다. 그러나, 내가 질환의 많은 부분이 처리 되지 않습니다 효과적으로 조직의 의약품 안전 청에 의해 내가^3,4에 마약 사용을 제한 하는 혈액-미로 장벽 때문에. 반면, 지역 마약 배달 전략 내가 장애를 보다 효율적으로 처리할 수 있습니다. 사실, 내가 잠재적으로 로컬 약물 전달;에 대 한 이상적인 목표 한 사이트 유포 또는 주입 후 약의 보급을 용이 하 게, 유체로 가득 그리고 인접 장기에서 상대적으로 고립 된 부작용^5,6제한.

지역 마약 배달 전략 intratympanic 및 intralabyrinthine 메서드가 포함 됩니다. Intratympanic 루트의 효과 크게 둥근 창 막 (RWM)와 RWM^3,4,,78에 약물의 체류 시간을 통해 마약 침투성에 의존합니다. 따라서, 약물 이나는 RWM 뚫을 수 없는 시 약의 납품에 대 한 적당 하다. Intralabyrinthine 메서드는 약물의 높은 복용량에 광범위 하 게 배포 결과 내가 직접 접종을 포함 한다. 그러나, intralabyrinthine 방법 섬세 한 수술을 요구 하 고 침략 적, 선도 내가 기능을 손상 하는. 현재, 인간⁹에 사용 하기 위해 충분히 안전한 것으로 증명 되지 않았습니다 intralabyrinthine 주입 약물의 동물 연구에만 사용 됩니다. 따라서, 수술 절차를 단순화 해야 합니다, 그리고 상해의 위험 감소 병원에 intralabyrinthine 접근을 번역 하.

몇몇 intralabyrinthine 접근 RWM^5,,1011 와 스칼라 미디어^12,,1314, scala tympani에 주입 하 여 동물에 부과 하 고 있다 ^{15 , 16}, 스칼라 현관¹⁷, 반원의 운하^16,18,,1920그리고²¹endolymphatic sac. 방법 마다 장단점⁶. 납품은 RWM 통해 신생아 쥐^5,22에 atraumatic입니다. 그러나, 가벼운 난청 RWM 주입²³, 수술²⁴후 중이 토로 인해 가능성이 후 성인 쥐에서 관찰 됩니다. 대상 최종 기관^12,14, 에서 높은 시 약 농도 달성 하는 스칼라 미디어 주입, 직접 우주로 endolymphatic 감각 상피를 포함 하는 시 약의 주입을 포함 한다, ^{25 , 그러나 26}.,이 이렇게 복잡 한 절차를 요구 한다 고 심리 임계값의 상당한 상승 산 후 날 5 (P5) 보다 수행 하는 경우^25,27, 그것의 응용 프로그램을 제한.

위에서 언급 한 intralabyrinthine 방식에 비해, canalostomy 특히 성인 쥐^{16,18,,2829,30}에서 내가 최소한의 손상을 일으키는합니다 보호 효과 및 변환 측면의 평가 대 한 중요 한. 또한, 설치류, 반원의 운하 넘어 물집, 수술 절차를 용이 하 게 하 고 수술 하는 동안 중이 장애를 피할 수 있습니다. 클리닉, 반원의 운하 수술 다루기 힘든 양성 발작의 자세 현기증^31,,3233, canalostomy의 임상 타당성을 제안에 대 한 사용 됩니다. 이후 처음가 모토 외설명. ¹⁶ , 2001 년에 canalostomy murine 내가^{18,,1928,29로 바이러스 성 벡터, siRNA, 줄기 세포, aminoglycoside, 등 다양 한 시 약을 제공 하는 데 사용 되었습니다. ,,3435,,3637}. Canalostomy에 의해 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 접종 가능 감각 상피에 외 인 유전자의 overexpression 달팽이 관 및 vestibular 끝-장기^18,28, 의 기본 신경 ^29,30. Canalostomy에 의해 유전자 치료를 whirlin 균형 기능을 복원 하 고 인간의 안내인 증후군¹⁹, 그 canalostomy 유전자 cochleovestibular 질병에 대 한 유전자 치료의 연구에 대 한 유용한 제안 마우스 모델에서 청력을 향상 시킵니다. Canalostomy에 의해 중간 엽 줄기 세포의 이식 결과 인공 fibrocytes와 급성 감각 청각 손실³⁵의 쥐 모델에서 청력 회복의 개편. 또한, canalostomy aminoglycosides vestibular 병 변^18,,3438, 확립 하 내가 사용할 수 있습니다. 그리고¹⁸ 필요한 경우 여러 주사를 수행할 수 있습니다. ^{, 34}.

현재 문서에서 우리, 자세히 설명, 성인 및 신생아 쥐에 canalostomy 기술. 우리 canalostomy 후 즉각적이 고 장기 결과 평가 하기 위해 마우스 내가 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 (AAV8-GFP)와 스, 빠른 녹색 염료 및 AAV serotype 8 (AAV8)를 포함 하 여 다양 한 시 약을 주사.

Protocol

모든 절차와 동물 수술 동물 관리 및 사용 위원회 중국의 자본 의료 대학의의 지침에 따라 실시 했다. 1. 장치 준비 주입 정 (그림 1A)을 하려면 폴 리 이미 드 튜브를 연결 (내부 직경 114.3 µ m, 외경 139.7 µ m, 길이 3 cm) 폴 리 에틸렌 튜브를 (내부 직경 280 μ m, 외경 640 µ m, 길이 40 cm). Superglue를 사용 하 여 적어도 3 개의 응용 프로그램과 함께 연결 인감…

Representative Results

빠른 녹색 염료는 내가 있는 그것의 즉각적인 배포를 평가 하는 성인 및 신생아 쥐의 PSC에 주입 했다. 염료 (그림 4) 수술 후 바로 달팽이 관, 현관, 반원의 운하에 걸쳐 발견 되었다. 안전 및 내가 유전자 납품에 대 한 canalostomy의 효율성 평가, AAV8 GFP 성인 및 신생아 쥐의 내가 주입 했다. 모든 동물 전시 정?…

Discussion

이 연구에서 우리는 canalostomy에 의해 약물 전달 달팽이 관 vestibular 끝-장기에 걸쳐 시 약의 광범위 한 배포 결과 다는 것을 보였다. 내가 유전자 전달 방법으로 canalostomy는 청각 및 vestibular 함수에 최소한의 피해와 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 GFP 식에서 결과. 또한, 여러 주사 같은 동물에서 쉽게 수행할 수 있습니다.

그것은 특히 성인 쥐^16,<sup class="xre…

Materials

Polymide Tubing	A-M Systems	823400
Polyethylene Tubing	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1
10μl Microsyringe	Hamilton Company	80001
Xylazine HCL	Sigma-Aldrich Co. Llc.	X-1251
Operating Miroscope	Carl Zeiss Optical LLC.	Pico
Micro Forceps	Dumont Dumostar	10576
Fast-green Dye	Sigma-Aldrich Co. Llc.	F7252
AAV8-GFP	BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China)	20161101	Titer: 2×10e12 vg/mL
Streptomycin Sulfate	Sigma-Aldrich Co. Llc.	S9137
Microinjection Pump	Stoelting Co.	789100S
Electric Pad	Pet Fun	11072931136
1 cc Syringe	Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China)	2011-3151258
Ketamine HCL	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China)	H35020148
Electric Animal Clipper	Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China)	CP-8000
Cotton Pellet	Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China)	Yu-2008-1640081
Suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China)	Hu-2013-2650207
Eye Ointment	Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China)	H11021270