Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade
Summary
Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.
Abstract
Zamanmekansal hücre altı localization(s) bir protein hakkında bilgi fizyolojik fonksiyonları hücrelerdeki anlamak için önemlidir. Çılgınca floresan proteinler ve floresan füzyon proteinlerin üretimi doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri hücrelerdeki görselleştirmek için etkili bir araç kullanılmıştır. Bunları ortak ilgi sözcüğünden sonra ifade protein ile tanınmış organel işaretleri ile karşılaştırmak özellikle yararlıdır. Yine de, bitkilerde protein ortak ifade için Klasik yaklaşımlar genellikle birden çok bağımsız ifade plazmid içerir ve bu nedenle düşük ortak ifade verimliliği, ifade düzey varyasyon ve yüksek saat içerir dezavantajları var genetik geçiş ve eleme harcama. Bu çalışmada, bitkiler birden çok chimeric floresan proteinlerin ortak ifade için sağlam ve Roman yöntemi açıklanmaktadır. Bu birden fazla yarı bağımsız ifade kaset oluşan bir tek ifade vektör kullanarak geleneksel yöntemlerle sınırlamalar üstesinden gelir. Her protein ifade kaset kendi fonksiyonel proteini ifade öğeleri içerir ve bu nedenle bu esnek farklı ifade talebi karşılamak için ayarlanabilir. Ayrıca, kolay ve derleme gerçekleştirmek uygun ve en iyi duruma getirilmiş tek adımlı reaksiyon ek sindirim ve ligasyonu adımları olmadan kullanarak ifade plazmid DNA manipülasyonu parçaları. Ayrıca, dolu birarada olabilir ile mevcut floresan protein elde edilen biyo-görüntüleme teknolojileri ve uygulamaları, perde ve BiFC gibi. Bir doğrulama yöntemi, bu yeni sistemin fluorescently erimiş Co express katmaninin sıralama reseptör ve salgı taşıyıcı membran proteinlerinin çalıştırmaya başladık. Sonuçlar, onların bakış açısı hücre altı yerelleştirmeler geçici ifade ve bitkilerde genetik dönüşüm tarafından önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı olduğunu göstermektedir.
Introduction
Chimeric floresan füzyon proteinler hücre içi dinamikleri ve hücre altı yerelleştirme çalışma ve daha fizyolojik fonksiyonları ve çalışma mekanizmaları1,2, anlamak için yararlı araçlar kabul edilmiştir 3 , 4. eş express tanınmış organel muhabir proteinlere, kronolojik zamanmekansal mantığı, dağıtım ve function(s) hücreleri4 endomembrane sistemi içinde daha iyi göstermek için söz konusu protein ile özellikle faydalıdır , 5 , 6 , 7 , 8.
Chimeric floresan füzyon protein onların anılan sıraya göre avantajları ve sınırlamalar9,10,11olan bitkiler ile geçici ifade ve istikrarlı genetik dönüştürme, ifade edilebilir. Geçici bir protein ifadesidir biolistic bombardıman-, Polietilen glikol (PEG) içeren uygun bir yaklaşım-, veya DNA geçici ifade Elektroporasyon aracılı önceki ve Agrobacterium-yaprak infiltrasyon aracılı olduğu gibi bitki hücreleri, Şekil 1A, B12,13,14,15,16‘ da gösterildiği gibi. Ancak, ortak ifade tek bitki hücrede birden çok chimeric floresan füzyon proteinlerin çeşitli bağımsız ifade plazmid karışımı gerektirir. Böylece, birkaç plazmid aynı anda tek bir plazmid için karşılaştırıldığında aynı hücrelere girerek önemli ölçüde azaltılmış olasılığı nedeniyle ortak ifade düzeyi düşük tesislerinde protein ortak ifade birden çok plazmid istihdam sakıncaları vardır ve Plazmid hücre17,18aktarılan her türde kontrolsüzce rasgele miktarı nedeniyle protein ifade düzeyleri varyasyonları. Buna ek olarak, protein ortak ifade9,10,11tek Agrobacterium içine birkaç bağımsız ifade plazmid tanıtmak için teknik olarak zordur. Bu nedenle, Agrobacterium– Şekil 1Badımında gösterildiği gibi aracılı protein geçici ifade tütün infiltrasyonu tarafından bırakır sadece bir kerede bir plazmid ifade yeteneğine sahip. Buna ek olarak, floresan füzyon protein ifade Transgenik bitkilerin üretimi genellikle ikili dönüşüm vektör taşıyan Agrobacterium tarafından sağlanır. Ancak, gen transferi ve bitki genleri içine ekleme aracılık eder ikili vektör yalnızca bir tek floresan füzyon proteini (Şekil 1B)9,10,12ifade yeteneğine sahiptir. Aynı anda birkaç chimeric floresan proteinler ifade eder bir transgenik bitki üreten birden fazla mermi genetik geçiş ve ay sonra yıl genlerin sayıda bağlı olarak ortak ifade için gerçekleştirebileceğiniz tarama gerektirir.
Bir tek ifade vektör bitki birden çok proteinlerin ortak ifade için önceki birkaç tarafından bildirilmiştir istihdam19,20,21çalışmaları. Ancak, birden fazla mermi enzimatik sindirim ve DNA molekülleri ve omurga vektörel çizimler ligasyonu DNA protein Co ifadesi veya aşırı ifadesi için son plazmid nesil için genellikle gereklidir. Burada, birden çok chimeric floresan proteinler tesislerinde ortak ifade etmek için yeni ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bitkiler hem geçici ifade için birden fazla protein ortak ifade ve bir onur moda istikrarlı dönüştürme sağlar son derece verimli ve kullanışlı bir yöntemdir. Birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein ifade kaset protein ortak ifade içeren ve böylece geleneksel yöntemlerle sakıncaları üstesinden gelir bir tek vektör kullanır. Ayrıca, hangi DNA’manipülasyonlar ve derleme bir en iyi duruma getirilmiş basit tek adımlı DNA sindirim ve ligasyonu ile tepki ek adımlar olmadan elde edilir son derece çok yönlü sistemidir. Çalışma prensibi Şekil 2‘ de gösterilmiştir. Ayrıca, tamamen chimeric floresan füzyon protein üzerinde temel alan geçerli, moleküler, hücresel ve biyokimyasal yaklaşımlar ile uyumlu olduğunu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sağlam chimeric floresan füzyon protein tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem göstermiştir. Geçici ifade ve genetik dönüşümü için kullanılabilir ve geçerli floresan protein bazlı biyo-görüntüleme, moleküler ve biyokimyasal uygulamaları ve teknolojileri9,10ile,13 uyumludur . Buna ek olarak, protein ortak ifade için birkaç bireysel ifade plazmid kullanan geleneksel yöntemleri zorluklar …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar ve yorumlar için Wang laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NSFC, grant no. 31570001) ve doğal Bilim Vakfı Guangdong Eyaleti ve Guangzhou City (no. 2016A030313401 ve 201707010024 vermek) H.W. için desteklenir
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
