Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas
Summary
Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.
Abstract
Informações sobre a spatiotemporal localization(s) subcelular de uma proteína são fundamentais para entender suas funções fisiológicas nas células. Proteínas fluorescentes e geração de proteínas fluorescentes fusão tem sido usados descontroladamente como ferramenta eficaz Visualizar diretamente a localização da proteína e a dinâmica nas células. É especialmente útil para compará-los com marcadores de organela conhecido depois da expressão co com a proteína de interesse. No entanto, abordagens clássicas co na expressão de proteínas em plantas geralmente envolvem múltiplos plasmídeos de expressão independente e portanto tem inconvenientes que incluem eficiência baixa expressão co e variação do nível de expressão do que na hora despesas em cruzamento genético e triagem. Neste estudo, descrevemos um método robusto e inovador para expressão co de múltiplas proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. Ele supera as limitações dos métodos convencionais usando um vetor de expressão única que é composto de várias fitas expressando semi-independentes. Cada gaveta de expressão da proteína contém seus próprios elementos de expressão de proteínas funcionais, e, portanto, pode ser ajustado com flexibilidade para atender à demanda diversificada de expressão. Além disso, é fácil e conveniente para realizar a montagem e manipulação de DNA fragmentos no plasmídeo de expressão por meio de uma reação de uma etapa otimizado sem digestão adicional e passos de ligadura. Além disso, é totalmente compatível com tecnologias atuais de bio-imagem fluorescente proteínas derivadas e aplicações, tais como o traste e BiFC. Como uma validação do método, utilizamos este novo sistema receptor de classificação vacuolar express co fluorescente fundido e proteínas de membrana transportadora secretoras. Os resultados mostram que suas localizações subcellular perspectiva são os mesmos como em estudos anteriores pela expressão transiente e transformação genética em plantas.
Introduction
Proteínas quiméricas fluorescente fusão tem sido consideradas como ferramentas úteis para estudar a dinâmica intracelular e Localização subcellular e entender melhor suas funções fisiológicas e trabalho mecanismos1,2, 3 , 4. é especialmente benéfico para as proteínas de repórter de organela conhecido co express com a proteína em questão para ilustrar melhor sua lógica spatiotemporal, distribuição e funções dentro do sistema endomembranoso em células4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Uma proteína de fusão fluorescente quimérico pode ser expressa em plantas através de expressão transiente e transformação genética estável, que têm suas respectivas vantagens e limitações9,10,11. Expressão transitória de uma proteína é uma abordagem conveniente que inclui biobalística bombardeamento-, polietileno glicol (PEG)-, ou mediada por eletroporação DNA expressão transiente em protoplastas e Agrobacterium-mediada por infiltração de folha em células de vegetais intactos, como mostrado na figura 1A, B12,13,14,15,16. No entanto, a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em uma célula única planta requer uma mistura de vários plasmídeos de expressão independente. Assim, as desvantagens da contratação de múltiplos plasmídeos co na expressão de proteínas em plantas são baixos níveis de expressão co devido a drasticamente reduzida chance de vários plasmídeos entrar simultaneamente as mesmas células quando comparado a um único plasmídeo e o variações dos níveis de expressão de proteínas causadas pela quantidade incontrolavelmente aleatória de cada tipos de plasmídeo sendo transferido para a célula17,18. Além disso, é tecnicamente desafiador para introduzir vários plasmídeos de expressão independente em um único Agrobacterium para proteína expressão co9,10,11. Portanto, Agrobacterium-mediada por proteínas expressão transiente por infiltração de tabaco em folhas só é capaz de expressar um plasmídeo ao mesmo tempo, como mostrado na figura 1B. Em contraste, geração de plantas transgênicas expressando proteínas da fusão fluorescente geralmente é conseguida por Agrobacterium que carrega um vetor de transformação binário. No entanto, o vetor binário que medeia a transferência de genes e inserção em genomas a planta só é capaz de expressar uma fusão única de fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Gerando uma planta transgênica que expressa várias proteínas fluorescentes quiméricoes simultaneamente requer várias rodadas de cruzamento genético e triagem, que pode levar de meses a anos, dependendo do número de genes para ser co expressa.
O emprego de que um vetor de expressão única expressão co de múltiplas proteínas na planta tem sido relatado por vários anteriores estudos19,20,21. No entanto, várias rodadas de digestão enzimática e ligadura do DNA de moléculas de DNA e vetores de espinha dorsal são geralmente necessárias para geração do plasmídeo final para expressão de proteínas co ou sobre-expressão. Aqui, nós desenvolvemos um método novo e robusto para expressar co várias proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. É um método altamente eficiente e conveniente que atinge vários expressão co de proteínas em plantas para tanto expressão transiente e transformação estável de forma honrada. Ele emprega um vetor único que contém várias fitas de expressão de proteínas funcionalmente independente co na expressão de proteínas e, assim, supera os inconvenientes dos métodos convencionais. Além disso, é um sistema altamente versátil, no qual DNA manipulações e montagem são atingidos por uma reação de uma etapa simples otimizada sem etapas extras de digestão do DNA e da ligadura. O princípio de funcionamento está ilustrado na Figura 2. Além disso, é totalmente compatível com abordagens atuais de celulares, moleculares e bioquímicas que são baseadas em proteínas da fusão fluorescente quimérico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui temos demonstrado um método novo expressar robustamente co proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele pode ser usado tanto para expressão transiente e transformação genética e é compatível com o atual fluorescentes à base de proteínas de bio-imagem, moleculares e bioquímicos aplicativos e tecnologias9,10,13 . Além disso, ele supera as dificuldades dos métodos convencionais que usam vários plasm?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os membros do laboratório de discussões úteis e comentários Wang. Este trabalho é apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (NSFC, grant, n. º 31570001) e a Fundação ciência Natural da província de Guangdong e cidade de Guangzhou (conceder 201707010024 e n. º 2016A030313401) para H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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