Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen
Summary
Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.
Abstract
Informationen über die raumzeitlichen subzellulären Localization(s) eines Proteins ist entscheidend für seine physiologischen Funktionen in den Zellen zu verstehen. Fluoreszierende Proteine und Generierung von fluoreszierenden Fusionsproteine wurden Wild als ein wirksames Instrument zur Protein-Lokalisierung und Dynamik in den Zellen direkt sichtbar zu machen. Es ist besonders nützlich, um sie mit bekannten Organelle Marker nach Co Ausdruck mit dem Protein des Interesses zu vergleichen. Dennoch klassische Ansätzen für Co Proteinexpression in Pflanzen gewöhnlich mehrere unabhängige Ausdruck Plasmide, und daher haben Nachteile, die geringe Co-Expression Effizienz, Ausdruck-Ebene Variation und höchste Zeit enthalten Ausgaben in genetische Kreuzung und screening. In dieser Studie beschreiben wir eine robuste und neuartige Methode zur Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Proteine in Pflanzen. Es überwindet die Grenzen der herkömmlichen Methoden mithilfe einer einzigen Expressionsvektor, die aus mehreren semi-unabhängige mit dem Ausdruck ihrer Kassetten besteht. Jedes Protein Expressionskassette enthält eine eigene funktionsfähiges Protein-Expression-Elemente, und daher kann flexibel eingestellt werden um diverse Ausdruck Nachfrage gerecht zu werden. Auch, es ist einfach und bequem die Montage durchführen und Manipulation von DNA-Fragmenten in das expressionsplasmid durch den Einsatz einer optimierten einstufigen Reaktion ohne weitere Verdauung und Ligation Schritte. Darüber hinaus ist es kompatibel mit aktuellen fluoreszierenden Proteins abgeleitet Bio-Imaging-Technologien und Anwendungen, z. B. Bund und BiFC. Als eine Validierung der Methode haben wir dieses neue System Co Express eindringmittel verschmolzen vacuolar Sortier-Rezeptor und sekretorischen Träger Membranproteine beschäftigt. Die Ergebnisse zeigen, dass ihre Perspektive subzelluläre Lokalisierungen die gleichen wie in früheren Studien durch transiente Expression und genetische Transformation in Pflanzen sind.
Introduction
Chimären fluoreszierende Fusionsproteine gelten als nützliche Werkzeuge zur intrazellulären Dynamik und subzelluläre Lokalisation zu studieren und noch besser zu verstehen, ihre physiologischen Funktionen und funktionierende Mechanismen1,2, 3 , 4. es ist besonders vorteilhaft für Co Express bekannten Organelle Reporter Proteine mit dem Protein in Frage besser zu veranschaulichen, die räumlich-zeitliche Logik, Verteilung und Funktion(en) innerhalb des Endomembrane Systems in Zellen4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Eine Chimäre fluoreszierende Fusionsprotein kann ausgedrückt werden in Pflanzen durch transiente Expression und stabile genetische Veränderung, die ihre jeweiligen Vorteile und Einschränkungen9,10,11haben. Transiente Expression eines Proteins ist ein passender Ansatz, der biolistischen Bombardement-, Polyethylenglykol (PEG) enthält-, oder Elektroporation-vermittelte DNA transiente Expression in Protoplasten und Agrobakterium-vermittelten Blatt-Infiltration in intakten Pflanzenzellen, wie in Abbildung 1A, B12,13,14,15,16gezeigt. Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in einer einzigen Pflanzenzelle erfordert jedoch eine Mischung aus mehreren unabhängigen Ausdruck Plasmide. Somit sind die Nachteile des Einsatzes mehrere Plasmide für Co Proteinexpression in Pflanzen geringerer CO Ausdruck durch die deutlich geringere Chance auf mehrere Plasmide, die gleichzeitig in den gleichen Zellen im Vergleich zu einem einzigen Plasmid und die Variationen des Ausdrucks proteingehalte verursacht durch die unkontrolliert zufällige Menge jeder Art von Plasmid übertragen in der Zelle17,18. Darüber hinaus ist es technisch schwierig, mehrere unabhängige Ausdruck Plasmide in eine einzelne Agrobacterium für Protein Co9,10,11einzuführen. Daher Agrobakterium-vermittelten Protein transiente Expression durch Infiltration des Tabaks verlässt ist nur fähig auszudrücken ein Plasmid zu einem Zeitpunkt, wie in Abbildung 1 bgezeigt. Generation von transgenen Pflanzen, fluoreszierende Fusionsproteine erreichen dagegen in der Regel durch Agrobacterium , die eine binäre transformationsvektor trägt. Die binären Vektor, der Gentransfer und Einfügung in das Genom der Pflanze vermittelt ist jedoch nur in der Lage, mit dem Ausdruck einer einzigen fluoreszierende Fusion Protein (Abbildung 1 b)9,10,12. Generieren einer transgenen Pflanze, die mehrere Chimären fluoreszierende Proteine gleichzeitig zum Ausdruck bringt, erfordert mehrfache Umläufe der genetische Kreuzung und Abschirmung, die Monate bis Jahre abhängig von der Anzahl der Gene ergreifen kann, um Co ausgedrückt werden.
Die Beschäftigung, die ein einzelner Ausdruck Vektor für Co Ausdruck mehrere Proteine im Werk von mehreren früheren gemeldet wurde untersucht19,20,21. Mehrfache Umläufe der enzymatischen Verdauung und DNA-Ligation von DNA-Molekülen und Rückgrat Vektoren sind jedoch für die Erzeugung des endgültigen Plasmids für Co Proteinexpression oder Überexpression in der Regel erforderlich. Hier haben wir eine neue und robuste Methode zur Co Ausdruck mehrere Chimären fluoreszierende Proteine in Pflanzen entwickelt. Es ist eine höchst effiziente und komfortable Methode, die mehrere Co Proteinexpression in Anlagen für sowohl transiente Expression und stabile Transformation in eine altehrwürdige Weise erreicht. Es beschäftigt einen einzigen Vektor, der enthält mehrere funktionell unabhängig Protein Expressionskassetten für Co Proteinexpression und überwindet damit die Nachteile der herkömmlichen Methoden. Darüber hinaus ist es ein sehr vielseitiges System in die, das DNA Manipulationen und Montage durch eine einfache ein-Schritt optimiert Reaktion ohne zusätzliche Schritte des DNA-Verdauung und Ligation erreicht werden. Das Funktionsprinzip ist in Abbildung 2dargestellt. Darüber hinaus ist es kompatibel mit aktuellen zellulären, molekularen und biochemischen Ansätze, die auf Chimären fluoreszierende Fusionsproteine basieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir eine neuartige Methode auszudrücken, robust Chimären fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in Pflanzen Co demonstriert. Es kann für transiente Expression und genetische Transformation verwendet werden und ist kompatibel mit aktuellen fluoreszierende Protein-basierten Bio-Imaging, Molekulare und biochemische Anwendungen und Technologien9,10,13 . Darüber hinaus überwindet es die Schwierigkeiten von den herk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Mitgliedern des Wang Labors für hilfreiche Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant Nr. 31570001) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong und Guangzhou City (grant Nr. 2016A030313401 und 201707010024), h.w.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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