पौधों में एक कुशल तरीके में एकाधिक Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति
Summary
हम सह के लिए एक उपंयास विधि विकसित की है पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त पारंपरिक तरीकों की कठिनाइयों को दूर करने के लिए । यह एक एकल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है कि कई कार्यात्मक स्वतंत्र प्रोटीन व्यक्त कैसेट प्रोटीन सह प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्ति का उपयोग कर का लाभ लेता है ।
Abstract
एक प्रोटीन के spatiotemporal उपसेलुलर स्थानीयकरण (ओं) के बारे में जानकारी के लिए कोशिकाओं में अपने शारीरिक कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन और फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की पीढ़ी बेतहाशा एक प्रभावी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है सीधे प्रोटीन स्थानीयकरण और कोशिकाओं में गतिशीलता कल्पना । यह विशेष रूप से उंहें अच्छी तरह से सह के बाद organelle मार्करों के साथ तुलना उपयोगी है ब्याज के प्रोटीन के साथ अभिव्यक्ति । फिर भी, पौधों में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण आमतौर पर एक से अधिक स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids शामिल है, और इसलिए कमियां है कि कम सह अभिव्यक्ति दक्षता, अभिव्यक्ति स्तर भिंनता, और उच्च समय शामिल है आनुवंशिक पार और स्क्रीनिंग में व्यय । इस अध्ययन में, हम सह के लिए एक मजबूत और उपंयास विधि का वर्णन पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति । यह एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर कि कई अर्द्ध स्वतंत्र व्यक्त कैसेट से बना है का उपयोग करके पारंपरिक तरीकों की सीमाओं पर काबू । प्रत्येक प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट अपने स्वयं के कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति तत्व होते हैं, और इसलिए यह flexibly विविध अभिव्यक्ति की मांग को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, यह आसान है और विधानसभा और अतिरिक्त पाचन और बंधाव कदम के बिना एक अनुकूलित एक कदम प्रतिक्रिया का उपयोग करके अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में डीएनए टुकड़ों में हेरफेर करने के लिए सुविधाजनक है । इसके अलावा, यह वर्तमान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ पूरी तरह से संगत है जैव इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और ऐसे झल्लाहट और BiFC के रूप में अनुप्रयोगों, व्युत्पंन । विधि के सत्यापन के रूप में, हम सह एक्सप्रेस फ्लोरोसेंट vacuolar छंटाई रिसेप्टर और स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन से जुड़े इस नई प्रणाली कार्यरत हैं । परिणाम बताते है कि उनके परिप्रेक्ष्य उपसेलुलर स्थानीयकरण पिछले अध्ययनों में दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और पौधों में आनुवंशिक परिवर्तन के रूप में ही कर रहे हैं ।
Introduction
Chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन intracellular गतिशीलता और सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण के रूप में माना गया है और आगे उनके शारीरिक कार्यों को समझने और1,2तंत्र काम कर रहे, 3 , 4. यह विशेष रूप से सह व्यक्त करने के लिए फायदेमंद है प्रश्न में प्रोटीन के साथ अच्छी तरह से जाना जाता organelle रिपोर्टर प्रोटीन के लिए बेहतर अपने spatiotemporal तर्क, वितरण, और समारोह (ओं) endomembrane प्रणाली में4 कोशिकाओं में वर्णन , 5 , 6 , 7 , 8.
एक chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति और स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन है, जो उनके संबंधित लाभ और सीमाएं9,10,11के माध्यम से पौधों में व्यक्त किया जा सकता है । एक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति एक सुविधाजनक तरीका है कि, जो भी शामिल है–, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)-, या electroporation मध्यस्थता डीएनए protoplasts और एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता पत्ता घुसपैठ में परिवर्तनीय अभिव्यक्ति बरकरार संयंत्र कोशिकाओं, के रूप में चित्र 1a, बी12,13,14,15,16में दिखाया गया है । हालांकि, सह एक संयंत्र सेल में एकाधिक chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति कई स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids का एक मिश्रण की आवश्यकता है । इस प्रकार, पौधों में प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए एकाधिक plasmids रोजगार की कमियां कम सह अभिव्यक्ति के कारण कई plasmids के नाटकीय रूप से कम मौका एक साथ एक ही कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए एक ही प्लाज्मिड की तुलना में, और प्लाज्मिड के प्रत्येक प्रकार के बेकाबू यादृच्छिक राशि की वजह से प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के रूपांतरों सेल17,18में स्थानांतरित किया जा रहा है । इसके अलावा, यह प्रोटीन सह अभिव्यक्ति9,10,11के लिए एक एकल एग्रोबेक्टीरियम में कई स्वतंत्र अभिव्यक्ति plasmids शुरू करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, तंबाकू के पत्तों की घुसपैठ द्वारा एग्रोबेक्टीरियममध्यस्थता प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति केवल एक समय में एक प्लाज्मिड व्यक्त करने में सक्षम है, जैसा कि चित्र 1bमें दिखाया गया है । इसके विपरीत, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त संयंत्रों की पीढ़ी आमतौर पर एग्रोबेक्टीरियम है कि एक द्विआधारी परिवर्तन वेक्टर किया जाता द्वारा प्राप्त की है । हालांकि, द्विआधारी वेक्टर है कि संयंत्र जीनोम में जीन हस्तांतरण और प्रविष्टि मध्यस्थता केवल एक फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन (आंकड़ा 1b)9,10,12व्यक्त करने में सक्षम है । एक ट्रांसजेनिक संयंत्र जो कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त एक साथ उत्पादन आनुवंशिक पार और स्क्रीनिंग, जो महीनों से जीन की संख्या के आधार पर साल से ले जा सकते है सह व्यक्त की कई दौर की आवश्यकता है ।
रोजगार के लिए एक एकल अभिव्यक्ति वेक्टर सह के लिए संयंत्र में कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति पिछले अध्ययन द्वारा सूचित किया गया है19,20,21। हालांकि, एंजाइमी पाचन और डीएनए अणु और रीढ़ वैक्टर के डीएनए बंधाव के कई दौर आम तौर पर प्रोटीन सह अभिव्यक्ति या अधिक अभिव्यक्ति के लिए अंतिम प्लाज्मिड की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं । यहां, हम सह के लिए एक नया और मजबूत विधि विकसित की है पौधों में कई chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त । यह एक उच्च कुशल और सुविधाजनक तरीका है कि एक समय संमानित फैशन में परिवर्तनीय अभिव्यक्ति और स्थिर परिवर्तन दोनों के लिए पौधों में कई प्रोटीन सह अभिव्यक्ति प्राप्त है । यह एक वेक्टर है कि प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के लिए कई कार्यात्मक स्वतंत्र प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है और इस तरह पारंपरिक तरीकों की कमियां काबू में रोजगार । इसके अलावा, यह एक उच्च बहुमुखी प्रणाली है जिसमें डीएनए जोड़तोड़ और विधानसभा डीएनए पाचन और बंधाव के अतिरिक्त कदम के बिना एक सरल एक कदम अनुकूलित प्रतिक्रिया द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । कार्य सिद्धांत चित्रा 2में सचित्र है । इसके अलावा, यह वर्तमान सेलुलर, आणविक, और जैव रासायनिक दृष्टिकोण है कि chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन पर आधारित है के साथ पूरी तरह से संगत है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम मजबूती से सह करने के लिए एक उपंयास विधि का प्रदर्शन किया है, पौधों में chimeric फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हैं । यह दोनों क्षणिक अभिव्यक्ति और आनुवंशिक परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सक…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सहायक विचार विमर्श और टिप्पणियों के लिए वांग प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (NSFC, अनुदान no. ३१५७०००१) और प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन गुआंग्डोंग प्रांत और गुआंगज़ौ शहर (ग्रांट no. 2016A030313401 और २०१७०७०१००२४) को बुश hw
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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