Samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna på ett effektivt sätt i växter
Summary
Vi har utvecklat en ny metod för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter att övervinna svårigheterna med konventionella metoder. Det tar fördel av att använda en enda uttryck plasmid som innehåller flera funktionellt oberoende proteinet uttrycker kassetter för att uppnå samtidig proteinuttryck.
Abstract
Information om det spatiotemporal subcellulär localization(s) av ett protein som är viktigt att förstå dess fysiologiska funktioner i cellerna. Fluorescerande proteiner och generering av fluorescerande fusionsproteinerna använts vilt som ett effektivt verktyg att direkt visualisera den protein lokalisering och dynamiken i celler. Det är särskilt användbara för att jämföra dem med välkända organell markörer efter samtidig intresseanmälan med protein. Ändå klassiskt tillvägagångssätt för samtidig proteinuttryck i växter innebära brukar flera oberoende uttryck plasmider och därför har nackdelar som inkluderar låga Co uttryck effektivitet, uttryck-nivå variation och hög tid utgifter i genetiska crossing och screening. I denna studie beskriver vi en robust och ny metod för samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande proteiner i växter. Det övervinner begränsningarna av konventionella metoder med hjälp av en enda uttryck vektor som består av flera semi-oberoende uttrycker kassetter. Varje protein uttryck kassett innehåller sin egen funktionellt protein uttryckselement, och det därför flexibelt kan justeras för att möta efterfrågan på olika uttryck. Också, det är enkelt och bekvämt att utföra montering och manipulation av DNA fragment i uttrycket plasmiden med hjälp av en optimerad one-step reaktion utan ytterligare matsmältningen och ligatur steg. Dessutom är det fullt kompatibelt med fluorescerande protein härrör bio-imaging tekniker och tillämpningar som bandet och BiFC. Som en validering av metoden anställd vi detta nya system till samtidig express fluorescently smält vakuolär sortering receptor och sekretoriska membran bärarproteiner. Resultaten visar att deras perspektiv subcellulär lokaliseringar är densamma som i tidigare studier av både övergående uttryck och genetisk förändring i växter.
Introduction
Chimära fluorescerande fusionsproteinerna har betraktats som användbara verktyg för att studera intracellulära dynamics och subcellulär lokalisering och ytterligare förstå deras fysiologiska funktioner och fungerande mekanismer1,2, 3 , 4. det är särskilt fördelaktigt att samtidig express välkända organell reporter proteiner med proteinet i fråga att bättre illustrera dess spatiotemporal logiken, distribution och funktionerna inom det endomembrane systemet i celler4 , 5 , 6 , 7 , 8.
En chimär fluorescerande fusionsprotein kan uttryckas i växter via övergående uttryck och stabil genetiska förändring, som har sina respektive fördelar och begränsningar9,10,11. Övergående uttryck av ett protein är en bekväm metod som inkluderar biolistic bombardemang-, polyetylenglykol (PEG)-, eller elektroporation-medierad DNA övergående uttryck i protoplasts och Agrobacterium-medierad leaf infiltration i intakt växtceller, som visas i figur 1A, B12,13,14,15,16. Men kräver samtidig uttryck av flera chimära fluorescerande fusionsproteinerna i en enda anläggning cell en blandning av flera oberoende uttryck plasmider. Nackdelarna med sysselsätter flera plasmider för samtidig proteinuttryck i växter är således lägre Co uttryck nivåer på grund av dramatiskt reducerade risken för flera plasmider samtidigt in samma celler jämfört med en enda plasmid, och den varianter av protein uttryck nivåer orsakas av okontrollerat slumpmässiga mängden varje typer av plasmid överförs till den cell17,18. Det är dessutom tekniskt utmanande att införa flera oberoende uttryck plasmider i en enda Agrobacterium för protein samtidig uttryck9,10,11. Därför Agrobacterium-medierad protein övergående uttryck genom infiltration av tobak lämnar är endast kan uttrycka en plasmid i taget, som visas i figur 1B. Däremot uppnås generation av transgena växter uttrycker fluorescerande fusionsproteinerna vanligen genom Agrobacterium som bär en binär omvandling vektor. Binärt vektorn som förmedlar den genöverföring och införande i växten genomen är dock endast kan uttrycka en enda fluorescerande fusion protein (figur 1B)9,10,12. Generera en transgen växt som uttrycker flera chimära fluorescerande proteiner samtidigt kräver flera rundor av genetiska korsning och screening, vilket kan ta från månader till år beroende på antalet gener att uttryckas tillsammans.
Den sysselsättning som en enda uttryck vektor samtidig uttryck av flera proteiner i växten har rapporterats av flera tidigare studier19,20,21. Dock är flera rundor av enzymatisk nedbrytning och DNA-ligering av DNA-molekyler och ryggraden vektorer vanligtvis krävs för generering av slutliga plasmiden för samtidig proteinuttryck eller över uttryck. Här har vi en ny och robust metod för samtidig uttrycker flera chimära fluorescerande proteiner i växter. Det är en mycket effektiv och bekväm metod som uppnår flera samtidig proteinuttryck i växter för både övergående uttryck och stabil omvandling i en häfdvunna mode. Det sysselsätter en enda vektor som innehåller flera funktionellt oberoende proteinet uttryck kassetter för samtidig proteinuttryck och därmed övervinner nackdelarna med konventionella metoder. Dessutom är det ett mycket mångsidiga system i vilka DNA manipulationer och montering uppnås genom en enkel one-step optimerade reaktion utan extra steg DNA matsmältningen och ligatur. Arbetsgruppen principen illustreras i figur 2. Dessutom är det helt kompatibel med nuvarande cellulära, molekylära och biokemiska metoder som är baserade på chimära fluorescerande fusionsproteinerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi visat en ny metod för att kraftfullt samarbete express chimära fluorescerande fusionsproteiner i växter. Det kan användas för både övergående uttryck och genetisk transformation och är kompatibel med nuvarande fluorescerande protein-baserade bio-imaging, molekylära och biokemiska tillämpningar och tekniker9,10,13 . Dessutom övervinner det svårigheterna med konventionella metoder som använder flera indiv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna av Wang laboratoriet för bra diskussioner och kommentarer. Detta arbete stöds av den National Natural Science Foundation Kina (NSFC, grant nr 31570001) och naturvetenskap Foundation i provinsen Guangdong och Guangzhou City (bevilja nr 2016A030313401 och 201707010024) att H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
