Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura
Summary
Tessutale renale costrutti forniscono una soluzione per la carenza di organi e deleteri effetti della dialisi. Qui, descriviamo un protocollo a micro sezionare murini reni per isolamento di segmenti cortico-midollare. Questi segmenti sono impiantati nei costrutti senza impalcatura cellulare, formando organoids renale.
Abstract
Trapianto di rene è ora una terapia tradizionale per la malattia renale di stadio finale. Tuttavia, con circa 96.000 persone sulla lista d’attesa e solo un quarto di questi pazienti che hanno raggiunto il trapianto, c’è un disperato bisogno di alternative per quelli con mancanza di organi. Al fine di ridurre le conseguenze dannose di dialisi nonché i costi nel complesso sanitari che sostiene, indagine attiva è in corso in cerca di soluzioni alternative al trapianto d’organo. Impiantabili tessutale renale costrutti cellulari sono un tale approccio fattibile per sostituire la perdita di funzionalità renale. Qui, descritto per la prima volta, è il microdissection dei reni murini per l’isolamento di vivere corticomedullary renale segmenti. Questi segmenti sono capaci di rapida incorporazione all’interno senza impalcatura endoteliale-fibroblasto costrutti che consentono rapidi collegamenti con vasculature host una volta impiantato. Reni di topo adulto sono stati prelevati da donatori viventi, seguiti da stereoscopio microdissection ottenere segmenti renale 200-300 µm di diametro. Più costrutti renale furono fabbricati usando segmenti renale primarie raccolte da un solo rene. Questo metodo viene illustrata una procedura che potrebbe salvare il tessuto funzionale renale da organi che altrimenti sarebbe da scartare.
Introduction
Malattia renale cronica (CKD) è una delle attuali sfide importante di sanità pubblica in tutto il mondo1. La prevalenza di CKD negli Stati Uniti è oltre il 14% della popolazione totale, con oltre 600.000 americani soffrono la forma più grave, stadio finale malattia renale (ESRD)2. Le attuali opzioni di trattamento disponibili per quelli con ESRD includono dialisi e trapianto renale. Anche se circa 25.000 pazienti sottopongono a trapianto renale ogni anno, un numero significativo di pazienti vengono aggiunti ogni anno portando a una grande disparità tra quelli in attesa di un organo salva-vita e quelli riceventi trapianto3. Oltre ai suoi effetti negativi gravi sulla longevità e qualità della vita, la dialisi sono associato con un onere finanziario sorprendente. Nel 2014, Medicare pagato crediti ammontano a oltre $ 30 miliardi per ESRD pazienti2. Con un rifornimento limitato dell’organo e nessuna tendenza al ribasso apparente in pazienti che necessitano di dialisi, gli sforzi di ricerca finalizzati ad individuare soluzioni alternative alla dialisi e trapianto sono sempre importanti. Anche un relativamente breve ritardo nella necessità di dialisi aumenta sostanzialmente numero di un paziente di anni di vita di qualità-regolato e produttività mentre rinviando alla dialisi costi4,5,6.
Soluzioni per la perdita di tessuto funzionale, come quella in ESRD, sono attualmente allo studio in ingegneria tissutale e medicina rigenerativa laboratori, con approcci vari ampiamente da basati su impalcatura organoid fabbricazione a organo intero ingegneria utilizzando decellularized strutture dell’organo per l’impianto cellulare7,8,9,10,11. Ricapitolare complesse strutture renali dai reni marginali o scartati solo parzialmente è stato studiato. Infatti, quasi il 20% dei reni procurati per trapianto vengono scartati per vari motivi12,13. Il tessuto renale funzionale da questi presunti innesti potrebbe essere utilizzato e incorporato in uno o molti costrutti tessutale. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di lavorare con questi organi scartati, che utilizzano i reni per la matrice extra-cellulare per tessuto ingegneria fini14,15. Tuttavia, pochi hanno utilizzato il tessuto primario nephronal da reni sani per l’ingegneria dei tessuti fini16,17,18.
Un metodo precedentemente descritto da Kim et al. prevede isolamento di renale “segmenti” da reni sani del ratto, che poi sono stati seminati su impalcature di (PGA) acide poliglicolico per costrutto fabbricazione16. Tuttavia, poche informazioni sono dato per quanto riguarda la metodologia esatta dissezione e segmenti sono stati ottenuti da una combinazione di filtrazione e tritare bene. Descriviamo una modifica del presente protocollo, che analogamente produce segmenti discreti renale con architettura nephronal intatto, ma si basa invece sulle tecniche di microdissezione. Nefrectomie vengono eseguiti su topi adulti viventi, dopo di che i reni sono trasferiti il microscopio di dissezione dove la capsula renale è rimosso, e il tessuto è ulteriormente sezionato. Piccolo calibro 30½ G aghi sono usati come strumenti da taglio e anche come guide aiutando nella dissezione, come l’ago diametro è uguale al diametro del bersaglio dei segmenti renali. I segmenti isolati, in questo caso murini, renali mantengono vitalità nella cultura e incorporano con costrutti cellulari senza impalcatura endoteliale-fibroblasto19. Questi costrutti sono stati utilizzati precedentemente per altri organi, tra cui un pancreas artificiale bio20l’ingegnere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodi utilizzati per tessuto renale vivente costrutti variano notevolmente per quanto riguarda sia il tipo delle cellule e biomateriali utilizzati e in molti casi, l’ingegnere sono obsoleti o non ben caratterizzati in letteratura7. Mentre molti stanno usando cellule staminali approcci o ricapitolare i singoli componenti dell’architettura renale in isolamento, è la prospettiva di ricreare artificialmente un intero organo con oltre 26 tipi differenti delle cellule differenziate da sospensioni cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH istituzionale Postdoctoral Training Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
