Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo
Summary
Ingeniería de tejido renales construcciones proporcionan una solución para la escasez de órganos y los efectos deletéreos de la diálisis. Aquí, describimos un protocolo micro disecar riñones murinos para el aislamiento de segmentos córtico-medular. Estos segmentos están implantados en construcciones celulares libre de andamio, formando organoides renal.
Abstract
Trasplante de riñón es ahora una terapia convencional para la insuficiencia renal. Sin embargo, con aproximadamente 96.000 personas en la lista de espera y sólo una cuarta parte de estos pacientes conseguir trasplante, hay una extrema necesidad de alternativas para aquellas personas con falta de órganos. Para disminuir las consecuencias perjudiciales de diálisis junto con los costos en general profesional de la salud que ha incurrido, investigación activa está trabajando en la búsqueda de soluciones alternativas al trasplante de órganos. Construcciones celulares renales tejido-dirigida implantables son uno de los enfoques viable para reemplazar la funcionalidad renal perdida. Aquí, se describe por primera vez, es la microdisección de riñones murinos para el aislamiento de vivir corticomedullary segmentos renales. Estos segmentos son capaces de rápida incorporación dentro de construcciones de andamios gratis endoteliales fibroblastos que puede permitir la conexión rápida con vasculatura anfitrión una vez implantado. Riñones de ratón adulto se obtienen de donantes vivos, seguidos por el microdissection del Estereoscopio para obtener segmentos renales 200-300 μm de diámetro. Múltiples construcciones renales fueron fabricadas con segmentos renales primarios de único riñón. Este método muestra un procedimiento que podría salvar tejido renal funcional de órganos que de lo contrario serían descartados.
Introduction
Enfermedad renal crónica (ERC) es una de la actual salud pública desafíos en todo el mundo1. La prevalencia de ERC en Estados Unidos es más 14% de la población total, con más de 600.000 estadounidenses sufren de la forma más grave, la etapa del extremo enfermedad renal (terminal ERT)2. Las actuales opciones de tratamiento disponibles para aquellos con ERT incluyen trasplante de la diálisis y los riñones. Aunque aproximadamente 25.000 pacientes se someten a trasplante renal cada año, un número significativo de pacientes se agrega anualmente llevando a una gran disparidad entre aquellos en espera de un órgano vital y ésos receptores de trasplante3. Además de sus graves efectos negativos sobre la longevidad y calidad de vida, la diálisis se asocia con una sorprendente carga financiera. En 2014, Medicare pagada los reclamos sumaron sobre $ 30 billones para los pacientes ESRD2. Con un suministro limitado de órgano y no tendencia bajista aparente en pacientes que requieren diálisis, esfuerzos de investigación destinados a determinar soluciones alternativas a la diálisis y el trasplante son siempre importantes. Incluso un relativamente breve retraso en la necesidad de diálisis aumenta número de un paciente de años de vida ajustados por calidad y productividad substancialmente y aplazamiento de gastos relacionados con la diálisis4,5,6.
Soluciones para la pérdida de tejido funcional, como en ERT, se están estudiando actualmente en la ingeniería de tejidos y laboratorios de la medicina regenerativa, con enfoques muy variados desde organoide basadas en andamios fabricación órgano entero usando ingeniería decellularized estructuras del órgano para implantación celular7,8,9,10,11. Recapitulando complejas estructuras renales de los riñones marginales o desechados sólo parcialmente ha sido investigada. De hecho, casi 20% de riñones para trasplante son descartado por diversas razones12,13. El tejido renal funcional de estos supuestos injertos podría utilizado e incorporado en uno o varios constructos tejido-dirigida. Estudios previos han demostrado la viabilidad de trabajar con estos órganos desechados, utilizando riñones de la matriz extracelular de tejidos con fines de ingeniería14,15. Sin embargo, pocos han utilizado primario del tejido nephronal de los riñones sanos para ingeniería de tejidos con fines16,17,18.
Un método previamente descrito por Kim et al. implica aislamiento de “segmentos” renales de riñones de ratas sanas, que luego fueron sembrados en los andamios (PGA) ácidos poliglicólico para la construcción fabricación16. Sin embargo, poca información se da con respecto a la metodología de disección exacta y se obtuvieron segmentos de una combinación de filtración y picar fino. Se describe una modificación de este protocolo, que produce igualmente discretos segmentos renales con arquitectura nephronal intacta, pero en cambio se basa en técnicas de microdisección. Nefrectomías se realizan en la vida de ratones adultos, después de que los riñones se transfieren al microscopio de disección donde se quita la cápsula renal, y además se diseca el tejido. Agujas 30½ G pequeño tamaño se utilizan como instrumentos de corte y también como guías de ayuda en la disección, como la aguja diámetro es igual al diámetro del objetivo de los segmentos renales. Los segmentos aislados, en este caso murinos, renales mantienen viabilidad en cultivo e incorporan con construcciones celular libre andamio endoteliales fibroblastos19. Estas construcciones se han utilizado anteriormente para otros órganos, incluyendo páncreas bio-artificial20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos utilizados para tejido renal vivo constructos varían ampliamente en relación con el tipo de células y biomateriales utilizados y en muchos casos, son obsoletos o no bien caracterizado en la literatura7. Mientras que muchos utilizan enfoques de la célula de vástago o recapitulando los componentes individuales de la arquitectura renal aislada, es la posibilidad de recrear artificialmente un órgano entero con más de 26 tipos diferentes de célula diferenciada de suspensiones celulares…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH Grant institucional formación Postdoctoral, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
