ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة
Summary
هندسة الأنسجة بنيات الكلوي توفر حلاً للنقص في الجهاز والآثار الضارة للغسيل الكلوي. هنا، يمكننا وصف بروتوكول للصغير تشريح الكليتين مورين لعزل قطاعات كورتيكو النخاع. يتم زرع هذه الأجزاء في ثوابت خالية من السقالة الخلوية، تشكيل أورجانويدس الكلوي.
Abstract
زرع الكلي الآن علاج الرئيسي لنهاية مرحلة المرض الكلوي. ومع ذلك، مع حوالي 96,000 شخصا على قائمة الانتظار وإلا ربع هؤلاء المرضى تحقيق الزرع، هناك حاجة ماسة للبدائل لأولئك مع فشل الأجهزة. لتقليل الآثار الضارة لغسيل الكلي جنبا إلى جنب مع أنها تتحمل تكاليف الرعاية الصحية الشاملة، يجري التحقيق النشط بحثاً عن حلول بديلة لزرع الأعضاء. القابلة للغرس هندسة النسيج الكلوي الخلوي بنيات هي أحد هذه النهج الممكنة للاستعاضة عن فقدان الوظائف الكلوية. هنا، ووصف لأول مرة، هو ميكروديسيكشن للكليتين مورين للعزلة كورتيكوميدولاري المعيشية القطع الكلي. هذه القطاعات قادرة على التأسيس السريع داخل بنيات خالية من السقالة غشائي-تنتجها الخلايا الليفية التي قد تمكن من الاتصال السريع مع المفرج المضيف مرة مزروع. وتم شراء الكلي الماوس الكبار من المانحين المعيشة، تليها ميكروديسيكتيون ستيريوسكوبي للحصول على القطع الكلي 200-300 ميكرون في القطر. كانت ملفقة ثوابت كلوية متعددة استخدام شرائح الكلوي الابتدائية تحصد من كلية واحدة فقط. هذا الأسلوب يوضح إجراء الذي يمكن إنقاذ النسيج الكلوي الوظيفي من الأجهزة التي سوف يتم إهمالها على خلاف ذلك.
Introduction
أمراض الكلي المزمنة (كد) واحد من الحالية الرئيسية للصحة العامة التحديات في العالم1. انتشار كد في الولايات المتحدة ما يزيد على 14 في المائة من مجموع السكان، ومع ما يزيد على 600,000 الأمريكيين الذين يعانون من شكل أشد، نهاية مرحلة المرض الكلوي (المسببات)2. وتشمل خيارات العلاج الحالية المتاحة لتلك مع المسببات زرع الكلي والغسيل الكلوي. على الرغم من أن حوالي 25,000 المرضى الخضوع لزرع الكلي كل عام، تتم إضافة عدد كبير من المرضى سنوياً مما يؤدي إلى تفاوت كبير بين أولئك الذين ينتظرون جهازا المنقذة للحياة، و زرع تلك المستقبلة3. بالإضافة إلى آثارها السلبية الخطيرة على طول العمر ونوعية الحياة، يرتبط الغسيل الكلوي عبئا ماليا مذهل. في عام 2014، الرعاية الطبية دفع المطالبات بلغت ما يزيد على دولار 30 بیلیون للمسببات المرضى2. مع إمدادات محدودة من جهاز وليس الانخفاض الظاهر في المرضى الذين يحتاجون إلى غسيل الكلي، الجهود البحثية الرامية إلى تحديد الحلول البديلة للغسيل الكلوي وزرع مهمان من أي وقت مضى. حتى مهلة قصيرة نسبيا في الحاجة للغسيل الكلوي يزيد عدد المريض سنوات العمر المعدلة حسب نوعية وإنتاجية كبيرة بينما أرجأ التكاليف المتصلة بالغسيل الكلوي4،،من56.
وتجري حاليا دراسة الحلول لفقدان أنسجة وظيفية، مثل التي في المسببات، في مختبرات الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة نهوجا متنوعة على نطاق واسع بدءاً من التصنيع القائم على سقالة أورجانويد لكل جهاز باستخدام الهندسة ديسيلولاريزيد هياكل الجهاز لغرس الخلوية7،،من89،10،11. تم جزئيا فقط التحقيق أتصدى هياكل كلوية معقدة من الكليتين هامشية أو التخلص منها. في الواقع، يتم تجاهل 20% من شراء لزرع الكلي تقريبا لمختلف الأسباب12،13. يمكن استخدامها وإدراجها في واحد أو العديد من بنيات هندسة الأنسجة النسيج الكلوي الوظيفي من هذه الطعوم المفترضة. وقد أثبتت الدراسات السابقة إمكانية للعمل مع هذه الأجهزة المهملة، استخدام الكلي للمصفوفة خارج الخلوية لأغراض هندسة الأنسجة14،15. ومع ذلك، قليلة استخدمت الأنسجة نيفرونال الابتدائي من الكليتين صحية لهندسة الأنسجة أغراض16،،من1718.
يتضمن أسلوب واحد سبق وصف كيم وآخرون العزل الكلي “شرائح” من الفئران صحية الكليتين، التي كانت تبذر ثم على السقالات (PGA) حمض بوليجليكوليك لبناء تصنيع16. بيد أن تعطي سوى القليل من المعلومات بشأن منهجية تشريح دقيق وتم الحصول على شرائح من مزيج من تنميق غرامة والترشيح. يصف لنا إدخال تعديل على هذا البروتوكول، وكذلك تنتج شرائح الكلوي المنفصلة مع الهندسة المعمارية نيفرونال سليمة، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تقنيات ميكروديسيكشن. نيفريكتوميس تجري على الفئران الحية الكبار، بعدها يتم نقل الكلي إلى مجهر التشريح حيث يتم إزالة الكبسولة الكلوي، وكذلك يتم تشريح الأنسجة. وتستخدم كأدوات لقطع العيار الصغير ز 30 الإبر وأيضا كأدلة مساعدة في التشريح، الإبرة قطرها يساوي القطر المستهدفة من شرائح الكلوي. شرائح معزولة، وفي هذه الحالة مورين، الكلوي الحفاظ على استمرارية في الثقافة وتدمج مع ثوابت خالية من السقالة غشائي-تنتجها الخلايا الليفية الخلوية19. قد استخدمت سابقا هذه الثوابت لمهندس الأجهزة الأخرى، بما في ذلك بنكرياس اصطناعي بيو20.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق المستخدمة لهندسة الأنسجة الكلوية الحية ثوابت تختلف على نطاق واسع فيما يتعلق بكل نوع من الخلايا والمواد الحيوية المستخدمة، وفي كثير من الحالات، التي عفا عليها الزمن أو لا يميز جيدا في الأدب7. بينما كثير تستخدم الخلايا الجذعية نهج أو لخص المكونات الفردية للهيكل الكلي بمع…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
منحة التدريب ما بعد الدكتوراه المؤسسي المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
