Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie
Summary
Weefsel-engineered renale constructies bieden een oplossing voor het tekort aan organen en de schadelijke effecten van dialyse. Hier beschrijven we een protocol bij micro ontleden lymfkliertest nieren voor isolatie van cortico-Wallenberg segmenten. Deze segmenten zijn steiger-vrije cellulaire constructies, vorming van renale organoids ingeplant.
Abstract
Niertransplantatie is nu een reguliere therapie voor einde-fase nierziekte. Met ongeveer 96.000 mensen op de wachtlijst en slechts een kwart van deze patiënten bereiken van transplantatie, is er echter een grote behoefte voor alternatieven voor degenen met falende organen. Ter vermindering van de schadelijke gevolgen van dialyse samen met de totale gezondheidskosten die het oploopt, is actief onderzoek voortdurend op zoek naar alternatieve oplossingen voor orgaantransplantatie. Implanteerbare weefsel-engineered renale cellulaire constructies zijn een dergelijke haalbare benadering ter vervanging van verloren renale functionaliteit. Beschreven voor de eerste keer, hier is de microdissection van lymfkliertest nieren voor isolatie van levende corticomedullary renale segmenten. Deze segmenten zijn geschikt voor snelle integratie binnen steiger-vrije endotheel-fibroblast constructies waarmee snelle verbinding met host therapieën eenmaal geïmplanteerd kan. Volwassen muis nieren waren verkregen van levende donoren, gevolgd door de stereoscoop microdissection verkrijgen van renale segmenten 200-300 µm in diameter. Meerdere renale constructies werden vervaardigd gebruikend primaire renale segmenten geoogst van slechts één nier. Deze methode geeft aan een procedure die functionele nier weefsel van organen die anders zouden worden weggegooid kon redden.
Introduction
Chronische nierziekten (CKD) is één van de huidige grote volksgezondheid uitdagingen wereldwijd1. De prevalentie van Cementovenstof in de Verenigde Staten is meer dan 14% van de totale bevolking, met meer dan 600.000 Amerikanen lijden aan de meest ernstige vorm, eind-fase nierziekte (ESRD)2. De huidige behandelingsopties beschikbaar voor mensen met ESRD omvatten dialyse en de nieren transplantatie. Hoewel ongeveer 25.000 patiënten ondergaan niertransplantatie elk jaar, zijn een groot aantal patiënten toegevoegd jaarlijks leidt tot een grote ongelijkheid tussen degenen die wachten op een levensreddende orgel en die ontvangende transplantatie3. Naast haar ernstige negatieve gevolgen op de lange levensduur en kwaliteit van leven wordt dialyse geassocieerd met een verbazingwekkende financiële lasten. In 2014 bedroeg Medicare betaald vorderingen meer dan $30 miljard voor ESRD patiënten2. Met de levering van een beperkt orgel en geen duidelijk dalende bij patiënten waarbij dialyse, onderzoek gericht op het identificeren van alternatieve oplossingen voor dialyse en transplantatie zijn ooit belangrijk. Zelfs een relatief korte vertraging in de noodzaak van dialyse stijgt van een patiënt aantal kwaliteit-aangepast levensjaren en productiviteit aanzienlijk terwijl het uitstel van de dialyse-gerelateerde kosten4,5,6.
Oplossingen voor functionele weefsel schade, zoals die in ESRD, worden momenteel bestudeerd in de weefselkweek en regeneratieve geneeskunde laboratoria, met gevarieerd benaderingen variërend van steiger gebaseerde organoid fabricage tot hele orgel engineering met behulp van decellularized orgel structuren voor cellulaire implantatie7,8,9,10,11. Recapitulerend complexe renale structuren van marginale of afgedankte nieren is slechts gedeeltelijk onderzocht. In feite, is bijna 20% van de nieren voor transplantatie aangeschaft teruggegooid voor verschillende redenen12,13. De functionele nier weefsel van deze vermeende protheses kan worden gebruikt en opgenomen in één of meerdere weefsel-engineered constructies. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat de haalbaarheid van het werken met deze afgedankte organen, gebruik makend van de nieren voor de extra-cellulaire matrix voor weefsel engineering doeleinden14,15. Weinigen hebben echter de primaire nephronal weefsel van gezonde nieren gebruikt voor weefselengineering doeleinden16,17,18.
Een methode die hierboven worden beschreven door Kim et al. omvat isolatie van renale “segmenten” vanaf gezonde rat nieren, die vervolgens werden zaadjes op polyglycolic zuur (PGA) steigers voor construct fabricage16. Echter weinig informatie wordt gegeven met betrekking tot de exacte dissectie methodologie en segmenten werden verkregen uit een combinatie van fijn hakken en filtratie. We beschrijven een wijziging van dit protocol, dat ook produceert discrete renale segmenten met intact nephronal architectuur, maar in plaats daarvan vertrouwt op microdissection technieken. Nephrectomies worden uitgevoerd op levende volwassen muizen, waarna de nieren worden overgedragen aan de dissectie Microscoop waar de renale capsule wordt verwijderd en het weefsel is verder ontleed. Lijst 30½ G naalden worden gebruikt als snijden instrumenten en ook als gidsen helpend in dissectie, als de naald diameter is gelijk aan de diameter van de doelstelling van de renale segmenten. De geïsoleerde, in dit geval lymfkliertest, renale segmenten behouden levensvatbaarheid in cultuur en nemen met steiger-vrije endotheel-fibroblast cellulaire constructies19. Deze constructies zijn eerder gebruikt om andere organen, met inbegrip van een bio-artificiële pancreas20ingenieur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Methoden die worden gebruikt om ingenieur levend renale weefsel constructies sterk uiteen ten aanzien van zowel het type van cellen en biomaterialen gebruikt, en in veel gevallen lopen zijn verouderd of niet goed gekarakteriseerd in de literatuur7. Terwijl velen maken gebruik van benaderingen van de cel van de stam of Recapitulerend afzonderlijke onderdelen van de renale architectuur in isolement, het vooruitzicht van kunstmatig het herscheppen van een gehele orgaan met meer dan 26 verschillende g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH institutionele postdoctorale opleiding Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016)
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association – European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
