A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel
Summary
Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.
Abstract
Imagem latente da viver-pilha é uma técnica poderosa que pode ser usada para visualizar diretamente fenômenos biológicos em células únicas durante longos períodos de tempo. Na última década, tecnologias novas e inovadoras melhoraram grandemente a praticidade da imagem latente da viver-pilha. As células podem agora ser mantidas em foco e continuamente imagem durante vários dias, enquanto mantida sob a 37 °C e 5% CO2 condições de cultura celular. Além disso, vários campos de visão que representam diferentes condições experimentais podem ser adquiridos em simultâneo, proporcionando elevado-throughput dados experimentais. Imagem latente da viver-pilha fornece uma vantagem significativa sobre imagem fixa-celular, permitindo a visualização direta e quantificação temporal de eventos celulares dinâmicos. Imagem latente da viver-pilha também pode identificar a variação no comportamento de células únicas que seria caso contrário ter sido perdido usando ensaios baseados na população. Aqui, descrevemos a viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel. Vamos demonstrar métodos para visualizar se mitotically prenderam células morrem diretamente da mitose ou slip volta em interfase. Também descreveremos como o sistema de indicadores (FUCCI) fluorescente ciclo celular baseado em do pode ser usado para avaliar a fração de células de interfase nascida do resvalamento mitótico que são capazes de re-introdução do ciclo celular. Finalmente, descrevemos um método de viver-pilha de imagens para identificar eventos de ruptura do envelope nuclear.
Introduction
Drogas antimitóticas têm sido muito utilizadas nos regimes quimioterápicos de vários tipos de tumores sólidos e frequentemente apresentam grande eficácia1,2,3. Mecanicamente, estas drogas perturbar a normal progressão mitótica e promover a prisão mitótica proliferam rapidamente as células cancerosas. No entanto, destino de célula em resposta a prisão mitótica é bastante variável: enquanto uma fração das células sofre morte celular diretamente da mitose, outros saída da mitose e retornar para o interphase como células tetraploide (um processo denominado slippage mitótico)4, 5,6,7,8. Estas células de interfase podem executar apoptose, sofrer prisão permanente ciclo celular ou mesmo re-introduzir o ciclo celular4,5,6,7,8,9 ,10,11. Células que evitar a morte celular mitótica pelo deslizar na interfase, somente para re-introduzir o ciclo celular após a remoção da droga, portanto, podem contribuir para a re-emergência de populações de células de câncer. Além disso, as células que deslize de mitose são tetraploide, e tetraploidy é conhecido por promover a instabilidade de cromossomo que impulsiona o tumor recaída12,13,14,15. Definir os fatores que controlam o destino da célula em resposta a tratamentos com drogas antimitótica, portanto, é fundamental para otimizar a terapêutica atual.
Neste protocolo, descrevemos os métodos para diretamente observar e estudar o destino das células que se submetem a prolongada detenção mitótica em resposta ao paclitaxel droga antimitótica. Paclitaxel é estabelecido terapêutico na clínica e provou-se altamente eficaz em muitos tipos de tumores, incluindo os de mama, ovários e pulmões16,17,18,19, 20. Paclitaxel, que é um alcaloide vegetal derivado da casca da árvore do Yew, estabiliza os microtúbulos e evita sua dinamicidade21,22. Enquanto o amortecimento da dinâmica do microtubule por paclitaxel não afeta a progressão do ciclo celular entre G e1 G2, a droga leva a ativação sustentada do ponto de verificação de montagem do eixo durante a mitose por dificultando acessório do microtubule-cinetócoro (revisto em profundidade aqui23,24)25. Como consequência, início da anáfase é impedido em células tratados com paclitaxel e resultados em uma detenção prolongada mitótica.
Este protocolo irá primeiro descrever abordagens para identificar células mitóticas em experiências de imagens ao vivo-celular. Mitose pode ser visualizada em células de cultura de tecidos aderentes devido a duas alterações biológicas de célula perceptível. Primeiro, cromossomos tornam-se altamente condensados imediatamente antes da ruptura do envelope nuclear. Enquanto muitas vezes detectável por microscopia de contraste de fase padrão, condensação do cromossomo pode ser mais claramente detectada usar fluorescente tags esse rótulo cromossomas (por exemplo, as proteínas fluorescente-etiquetadas histona). Segunda, mitóticas de células também podem ser identificadas pelo dramáticas mudanças morfológicas que resultam de arredondamento de célula.
Este protocolo então irá demonstrar como usar abordagens de imagens ao vivo-celular para controlar o destino das células experimentando prolongada detenção mitótica. Preso na mitose de células passam por um dos três destinos distintos. Primeiro, as células podem sofrer morte celular durante a mitose. Este fenômeno é facilmente visualizado por microscopia de luz, como são observadas células morrendo para psiquiatra, bolha, e/ou ruptura. Em segundo lugar, células podem sair da mitose e retorno para interphase sem segregação do cromossomo ou citocinese, um processo denominado resvalamento mitótico. Ocorre a descondensação dos cromossomos e/ou o achatamento da célula mitótica prontamente identifica este processo. Células que escorrega da mitose também frequentemente exibir núcleos múltiplos lóbulos, irregulares e frequentemente abrigam vários micronúcleos5. Em terceiro lugar, presos na mitose de células podem iniciar anáfase e prosseguir através de mitose, após um longo atraso. Apesar de incomum em altas concentrações de droga, esse comportamento sugere que as células presas podem ter satisfeito o ponto de verificação do conjunto de eixo, ou que o ponto de verificação do conjunto de eixo é parcialmente enfraquecido ou defeituoso. Início da anáfase pode ser visualizado pela segregação do cromossomo e citocinese subsequente usando a imagem latente da viver-pilha.
Viver-pilha de imagem métodos para controlar o destino das células que iludir a morte celular mitótica através de deslizamento mitótico também serão descritos. Células que passam por deslizamento mitótico morrem no período do intérfase subsequente, desencadear uma detenção de ciclo celular de1 G durável ou re-introduzir o ciclo celular para iniciar um novo ciclo de divisão celular4. Uma abordagem usando o sistema de FUCCI (fluorescente ciclo celular baseado em do indicador) para determinar a fração de células que re-introduzir o ciclo celular mitótica derrapagem a seguir será descrita. FUCCI, permite a visualização directa da transição G1/s e pode ser usado em conjunto com a longo prazo viver-pilha de imagem tanto in vitro e in vivode26,27. O sistema FUCCI aproveita-se de duas proteínas fluorescente etiquetadas, truncadas formas de hCdt1 (licenciamento de cromatina e replicação do DNA factor 1) e hGeminin, cujos níveis oscilam com base na posição do ciclo celular. hCdt1 (fundido a uma proteína fluorescente vermelha) está presente em níveis elevados durante a fase de1 G onde atua para licenciar o DNA para replicação, mas é ubiquitinated pelo E3 ubiquitina ligase do SCFSkp2 e degradadas nas fases S/G2/m para evitar Re-replicação do DNA,26. Por outro lado, hGeminin (fundido a uma proteína verde fluorescente), é um inibidor de hCdt1 cujo pico de níveis durante S/G2/M, mas é ubiquitinated pelo E3 ubiquitina ligase do APCCdh1 e degradado no final da mitose e em toda a G1 26. por conseguinte, FUCCI oferece uma leitura de fluorescência direta da fase do ciclo celular, como células exibem fluorescência vermelha durante da fluorescência verde e1, G durante S/G2/M. O sistema FUCCI é um avanço significativo sobre outras abordagens (como a coloração de bromodeoxyuridine) para identificar células proliferativas, porque não exige a fixação de célula e permite a imagem única célula sem a necessidade de adicional farmacológica tratamentos para sincronizar populações de células. Embora não discutidos neste protocolo, sensores de viver-pilha adicionais também foram desenvolvidos para visualizar a progressão do ciclo celular, incluindo um sensor do helicase B G128, DNA ligase-RFP29 e sensores de30 PCDNA-GFP para a fase S e o recente FUCCI-4 sensor, que detecta todas as fases do ciclo celular31.
Finalmente, será descrito um método de imagem de viver-pilha para detectar a ruptura do envelope nuclear. Estudos recentes têm revelado que os envelopes nucleares das células cancerosas são instável e propenso a estourar, permitindo assim que o conteúdo do nucleoplasma e o citoplasma para misturar. Este fenômeno, denominado ruptura nuclear, pode promover danos ao DNA e estimulação da resposta imune inata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. enquanto as causas subjacentes da ruptura nuclear permanecem incompleta caracterizadas, sabe-se que as deformações na estrutura nuclear correlacionam com um aumento da incidência de ruptura nuclear42. Um conhecido efeito do tratamento com paclitaxel é a geração de contundentemente anormais estruturas nucleares após a mitose; como tal, um método usando a imagem latente viver-pilha quantificar ruptura nuclear será descrito, enquanto explora também se paclitaxel tratamento aumenta a frequência de eventos de ruptura nuclear. Ruptura nuclear pode ser detectada pelo escapamento observado de uma proteína fluorescente nuclear-alvo para o citoplasma (por exemplo, um dímero em tandem repeat de RFP fundido a um sinal de localização nuclear, TDRFP-NLS). Este escapamento é claramente visível a olho nu, que permite a quantificação simples de eventos de ruptura.
Este protocolo requer um microscópio de epifluorescência widefield que está equipado com um palco codificado e software de focagem automática. O estágio codificado permite movimento automatizado preciso para definidas as coordenadas X-Y, enquanto software de autofoco mantém células em foco para a duração do período de imagem. Além disso, este protocolo requer equipamento para manter úmido de células a 37 ° C com 5% CO2 atmosfera. Isto pode ser conseguido colocando-se o microscópio inteiro dentro de uma temperatura e atmosfera controlada de cerco, ou usando dispositivos de palco-top localmente que mantém a temperatura e ambiente. O objetivo de contraste de fase, utilizado neste protocolo é um fluor plano 10 x com uma abertura numérica de 0,30. No entanto, 20 objetivos X também são suficientes para identificar as duas células arredondadas interfase mitótica e achatado em um único plano focal. Se executar o contraste de fase de imagem (como descrito neste método), a tampa pode ser ou o vidro ou o plástico. Se a microscopia de interferência diferencial (DIC) de contraste é usada, é imperativo usar uma tampa de vidro para impedir a despolarização da luz.
Protocol
Representative Results
Discussion
O aspecto mais importante da imagem latente da viver-pilha a longo prazo é garantir a saúde das células sendo fotografada. É essencial que as células sejam expostas a mínimas externos estressores ambientais, tais como condições precárias em relação a temperatura, umidade e/ou os níveis de CO2 . Também é importante limitar Fotodano de iluminação fluorescente de excitação, como stress de imagem é conhecido por afetar o comportamento de célula50. Limitar o Fotodano pode…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV e NJG gostaria de agradecer Ryan Quinton para comentários sobre o manuscrito e Adrian sálica para a construção de TDRFP-NLS. AFB e MAV são financiados pelo 5T32GM008541 NIGMS Biomolecular farmacologia formação Grant. NJG é um membro da ISA e Ashraf Dahod laboratórios de pesquisa de câncer da mama e é apoiado por subsídios de NIH GM117150 e CA-154531, a Karin Grunebaum Foundation, programa de prêmios da família Smith, o programa de estudiosos de Searle e a pesquisa de Melanoma Aliança.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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