Практического использования РНК-интерференции: устные доставка двуцепочечной РНК в липосомы перевозчиков для тараканов
Summary
Эта рукопись демонстрирует истощение экспрессии генов в средняя таракан через пероральный прием двуцепочечные РНК, инкапсулированные в липосомах.
Abstract
РНК-интерференции (RNAi) широко применяется для расчехлять биологические функции многочисленных генов и было предусмотрено как управления эксплуатации инструмент вредителей путем нарушения экспрессии важно генов. Хотя различные методы, такие как инъекции, кормления и замачивания, были зарегистрированы для успешной доставки двуцепочечной РНК (dsRNA), эффективность RNAi путем перорального двуцепочечной ДНК сильно варьируется среди различных групп насекомых. Таракан, германский Blattella, очень чувствительна к инъекции двуцепочечной ДНК, как показано во многих исследованиях, опубликованных ранее. Настоящее исследование описывает метод продемонстрировать, что малым интерферирующим РНК, инкапсулированный с липосомами перевозчиков достаточно, чтобы замедлить деградацию двуцепочечной ДНК, средняя сок. Примечательно непрерывное питание двуцепочечной ДНК, инкапсулированные в липосомах значительно уменьшает выражение тубулина в средняя и привело к смерти тараканов. В заключение разработки и использования lipoplexes двуцепочечной ДНК, которые защищают dsRNA против nucleases, может быть практического использования РНК-интерференции для насекомых-вредителей управления в будущем.
Introduction
RNAi продемонстрировал как эффективный метод для экспрессии генов нокдаун через механизм post-transcriptional глушителей пути, вызванные молекулы двуцепочечной ДНК многих эукариот1. В последнее десятилетие исследования RNAi стал полезным инструментом для изучения функций генов от разработки поведение истощения экспрессию конкретных генов через инъекции и/или кормления двуцепочечной ДНК в различные Таксоны насекомых2,3. Ввиду специфики и надежности разрушающих эффекта применение РНК-интерференции в настоящее время рассматривается как потенциальной стратегии для вредителей контроля управления4,5. Однако эффективность RNAi варьируется между видов насекомых, в зависимости от различных генов мишенью и методы доставки. Растущее количество доказательств свидетельствует о том, что нестабильность малым интерферирующим РНК, которая разлагается рибонуклеаз, является решающим фактором в ограниченной эффективности RNAi5,6. К примеру низкая чувствительность RNAi в Мандука sexta объясняется тот факт, что малым интерферирующим РНК, смешанного с гемолимфа быстро деградировавших в течение 1 часа7. Аналогичным образом наличие щелочной nucleases в средняя, которые эффективно снизить попадает малым интерферирующим РНК, сильно коррелирует с низкой эффективностью RNAi в различных насекомых заказы8,9,10.
Устные доставка двуцепочечной ДНК особенно интересен для применения RNAi в стратегию контроля вредителей, но задержать деградации двуцепочечной ДНК, nucleases в средняя не еще не разработан метод, который будет иметь потенциал для обеспечения эффективного RNAi через питание. Однако кормление большое количество двуцепочечной ДНК, например 50 мкг в Тутовый шелкопряд, или постоянно кормления на 8 дней (8 мкг двуцепочечной ДНК в общей сложности) в видов саранчи поступили зависания РНК-интерференции для перорального двуцепочечной ДНК. Таракан, Blattella germinica, очень чувствительна к RNAi путем инъекций dsRNA11,12,13,14, но не реагировать двуцепочечной ДНК через питание. Недавно, Линь и др. (2017) продемонстрировали двуцепочечной ДНК инкапсулированный с липосомами перевозчиков приводит к успешной RNAi в нокдаун экспрессии генов α-тубулина в средняя и вызвать значительные смертности таракан15. Как деградация двуцепочечной ДНК в средняя является ограничивающим фактором для устного интерференции, липосомы перевозчиков служат транспортное средство для защиты от деградации, которая легко применима в других насекомых, с сильным нуклеиназы мероприятий в кишечнике двуцепочечной ДНК. Записки, причина для выбора конкретного трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) мы использовали как липосом перевозчик в текущий протокол является, что она была протестирована на насекомых клеток линии трансфекции с менее токсичности, согласно инструкциями производителя. По словам сравнение различных липосом трансфекции систем в Гарави et al. (2013) 16, эффективность transfecting малые интерферирующие РНК (siRNA) составляет примерно то же самое между этой и других коммерчески доступных систем, которые были использованы для систем доставки двуцепочечной ДНК в других насекомых17,18 . Кроме того наш метод кормления достаточно внимательны обеспечить правильное количество dsRNA заглатывается каждой таракана, и что результаты являются надежными и подтверждено. Таким образом настоящий протокол и результаты показывают, что использование lipoplexes двуцепочечной ДНК улучшает стабильность двуцепочечной ДНК и открывает дверь к разработке стратегии устные доставки РНК-интерференции, который является перспективный подход для борьбы с вредителями в будущем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет метод для эффективного RNAi путем перорального двуцепочечной ДНК lipoplexes, связанных с защитой против рибонуклеазы переваривания в соке средняя таракан. Как показано в других исследованиях в различных видов насекомых, бедных RNAi эффект путем перорального dsRNA гла?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов из Тайваня (Министерство науки и технологии, наиболее 100-2923-B-002-002-MY3 и 106-2313-B-002-011-MY3 H.J.L.), Чешская Республика (Грант агентство Южно-чешский университет, GAJU Y.H.L предоставить 065/2017/P) и Испанию ( Испанского министерства экономики и конкурентоспособности, предоставляет CGL2012-36251 и CGL2015-64727-P X.B. и каталонского правительства, грант 2014 SGR 619 до X.B.); Он также получил финансовую поддержку от Европейского фонда для экономического и регионального развития (ФЕДЕР фонды для X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
