Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

Summary

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Abstract

Questo video presenta l’uso di microscopia elettronica di trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia (TEM-EDX) di confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. Queste linee cellulari, dopo il trattamento con acido ascorbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), subiscono transdifferenziazione osteogenica completa dalla proliferazione di mineralizzazione e produrre vescicole di matrice (MVs) che attivano la nucleazione apatite nella matrice extracellulare (ECM).

Basato su Alizarin Red-S (AR-S) colorazione e analisi della composizione dei minerali in lisati cellulari utilizzando la luce ultravioletta (UV) o in vescicole usando la formazione immagine TEM seguita da EDX quantificazione e mappatura dello ione, possiamo dedurre che osteosarcoma Saos-2 e osteoblastica le cellule hFOB 1.19 rivelano profili distinti di mineralizzazione. Cellule Saos-2 mineralizzano in modo più efficiente rispetto alle cellule hFOB 1.19 e producono più grandi depositi di minerali che non sono visibili ai raggi UV, ma sono simili a idrossiapatite (HA) in quanto hanno le sostituzioni più Ca e F.

I risultati ottenuti con queste tecniche ci permettono di concludere che il processo di mineralizzazione è diverso a seconda del tipo di cella. Proponiamo che, a livello cellulare, l’origine e la proprietà delle vescicole predeterminare il tipo di minerali.

Introduction

L’osso è un tipo di tessuto connettivo composto da due parti: organici (cellule e fibre collagene) e minerali (composti di calcio e fosfato). I componenti principali di minerali nelle ossa sono apatiti¹. Diversi tipi di cellule competenti di mineralizzazione in osso (osteoblasti), nei denti (odontoblasti) e nella cartilagine (condrociti) regolano i passi iniziali di mineralizzazione di produrre proteine della matrice extracellulare (ECM) e rilasciare la matrice vescicole (MVs) (Figura 1). MVs sono 100-300 nm diametro vescicole che si accumulano di calcio e fosfato facilitando la nucleazione apatite e successivamente associare al collagene^2,3. Quindi, MVs disintegrarsi per rilasciare apatiti al medium extracellulare. Le apatiti continuano a crescere a contatto con le fibre di collagene e formano la matrice dell’osso. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di P_io e Ca^{2 +} nel mezzo extracellulare. Alcuni dati recentemente pubblicati supportano il nostro modello^4,5. Tessuti molli non mineralizzare in condizioni fisiologiche. Tuttavia, la calcificazione ectopica può verificarsi in condizioni patologiche come calcificazione vascolare³. Le cellule vascolari che acquisiscono il fenotipo degli osteoblasti in grado di produrre MVs che inducono la nucleazione di apatiti e avviare mineralizzazione negli strati della parete mediale e intimale dei vasi sanguigni. Dal calcificazione ectopica assomigliano endochondral normale mineralizzazione³, comprendere i meccanismi molecolari della mineralizzazione delle cellule ossee e condrociti dovrebbero fornire alcuni indizi sulla calcificazione ectopica dei tessuti molli che sono formato.

Lo sviluppo di tessuti scheletrici è regolato da vari enzimi, fattori di crescita e promotori o inibitori della mineralizzazione. L’azione antagonistica di tessuto-non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) (Figura 1) ed ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi ho (NPP1), insieme a ankyrin (ANK), controlla concentrazione pirofosfato inorganico (PP_ho) ⁶. PP_ho, un potente inibitore della formazione HA, è idrolizzato di TNAP; NPP1 idrolizza i trifosfati del nucleotide per formare PP_ho mentre ANK PP_ho Esporta dalla cella alla ECM. Il rapporto di Pi/PPi può disciplinare l’apatite formazione^7,8 con possibili conseguenze patologiche⁹.

La membrana di MV è arricchita in proteine di trasporto dello ione che facilitano la precipitazione iniziale di calcio e fosfato all’interno la MVs durante il processo di nucleazione (Figura 1). Il trasportatore del fosfato 1 (PiT) consente di incorporare P_ho generato nello spazio perivesicular nel MVs^10,11. Annexins possono essere coinvolti nell’associazione e nel trasporto di Ca^{2 +} e nel processo biofisico che avvia la mineralizzazione del MV lumen^12,13. Favoriamo l’ipotesi, suggerito in precedenza, per mineralizzazione all’interno di vescicole intracitoplasmatiche di nucleazione interno di apatite dentro la MV prima della sua propagazione nell’ECM^14,15. Modellazione in vitro hanno confermato l’induzione di Ca^{2 +}/ p_ho complessi formazione nei proteoliposomi effettuata in PS e AnxA5¹⁶. Ciò potrebbe indicare che accumulo di Ca^{2 +}, P_ho, complessi AnxA5 e PS in “lipid rafts” di membranesrepresent i microvilli-come il nucleo di nucleazione (NC) di apatite all’interno Mvs Annexins e TNAP possiedono anche collagene-associazione capacità che possono essere utili nel mettere MVs lungo le fibre di collagene e, nello stimolare la propagazione di mineralizzazione in ECM. Fetuina A e osteopontina (OPN)¹⁷, sono noti come inibitori della formazione di apatite che possono rallentare la propagazione della mineralizzazione sul patibolo collageno. Nucleazione e propagazione sono eventi distinti, il primo precede quest’ultimo, ed entrambi possono essere rilevanti per il processo di mineralizzazione patologico.

Per scoprire come la chimica dei complessi di fosfato di calcio può cambiare fisiologico mineralizzazione e calcificazione ectopica, è necessario identificare i minerali prodotti dalle cellule. Apatiti sono un gruppo di calcio e fosfato contenente minerali con cristallo generale unità cella formula Ca₁₀(PO₄) di₆X₂, dove X = Cl, F, OH. Essi sono classificati come segue¹⁸: fluorapatite (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ e idrossiapatite (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

La scelta di linee cellulari di osteoblasti per indurre la formazione di minerali è fondamentale, poiché ogni linea cellulare esibisce un profilo distinto di mineralizzazione. In questo rapporto, abbiamo confrontato la nucleazione dei minerali da due modelli di cella selezionata umana di mineralizzazione: cellule osteoblastic hFOB 1.19 e cellule di osteosarcoma Saos-2. Cellule derivate da osteosarcoma sono comunemente usate come modelli osteoblastiche e cellule Saos-2 hanno conservato il carattere osteoblastic più maturo¹⁹ mentre le cellule indifferenziate hFOB fetale umano sono ampiamente usate come un modello per il normale osteoblastic differenziazione²⁰. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati con metodi diversi: Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletta visualizzazione luce (UV), formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione, quantificazione di energia dispersiva x-ray microanalisi (EDX) e dello ione mappatura. Il vantaggio di TEM-EDX su tecniche alternative utilizzate negli studi precedenti è che dà risultati quantitativi e qualitativi della sostituzione dello ione in cristalli di apatite^4,5,21. L’obiettivo generale dell’utilizzo di TEM-EDX era di trovare un metodo semplice per l’imaging e quantificazione della distribuzione degli ioni Ca, F e Cl in vari minerali da diversi tipi di cellule durante fasi distinte del processo di mineralizzazione. Questo metodo è stato utilizzato con successo, ad esempio, per monitorare l’interazione delle nanoparticelle di zinco con i prodotti chimici coesistenti e loro effetti combinati su organismi acquatici²². In un altro studio, un photocatalyst rame su materiali di titanio in soluzione acquosa è stato ampiamente caratterizzato mediante spettrometria ad emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman spettroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical misure²³. Il nostro obiettivo era di confrontare l’origine e la proprietà di vescicole e minerali in due linee cellulari per comprendere il meccanismo che controlla la mineralizzazione durante la differenziazione ossea.

Figura 1 . Schema delle fasi iniziali di mineralizzazione in cellule ossee che coinvolge la sintesi di proteine della matrice extracellulare (ECM) ed il rilascio delle vescicole della matrice (MVs) dalla membrana. MVs accumulare calcio attraverso l’azione di proteine leganti il calcio, annexins e fosfato, attraverso l’azione di un trasportatore di fosfato inorganico (PiT) seguita dall’attività del tessuto non specifico della fosfatasi alcalina (TNAP), che defosforila PP_io P_ho, quindi facilitante la nucleazione apatite. Quindi, MVs si disintegrano e rilasciare apatiti al medium extracellulare. La mineralizzazione è sostenuta dal costante rifornimento di P_io e Ca^{2 +} in extracellulare media^4,5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. cultura e trattamento delle cellule Mettere tutti i materiali necessari sotto la cappa a flusso laminare e sterilizzarli sotto luce UV. Terreni di coltura sono: una miscela 1:1 di prosciutto di media F12 e DMEM con 2,5 mM L-Glutammina completati con 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% siero bovino fetale (FBS) (v/v) per feto umano hFOB 1.19 grande T antigene SV40 transfettate osteoblasti e medio 5A di McCoy con 1,5 mM L-Glutammina completato con 100 U/mL di penicillina, 1…

Representative Results

TEM-EDX consente per l’imaging in vitro delle vescicole di matrice (MVs) rilasciate da mineralizzante di cellule e di minerali prodotti da Mvs i risultati ottenuti con questa tecnica dimostrano che il processo di mineralizzazione può procedere in modo diverso in vari tipi di cellule. Le linee due cellulari ricevuto lo stesso trattamento di transdifferenziazione osteoblastica, ancora stimolato le cellule Saos-2 in modo più efficiente rispetto hFOB mineralizzata 1,19 ost…

Discussion

Nella carta attuale, abbiamo descritto i protocolli per la macchiatura, identificazione di luce UV di fluoroapatite AR-S e TEM-EDX in vitro la formazione immagine di MVs rilasciato da mineralizzante di cellule e di minerali prodotto da MVs. È possibile indirizzare tutti i metodi sopra indicati di seguito alcuni passaggi di risoluzione dei problemi comuni. Per ottenere risultati ottimali, diversi passaggi critici devono essere eseguite con attenzione. In primo luogo, è meglio aggiungere AA (che è acid…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings