Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в прилежащем имеет решающее значение для прояснения дисфункции рецептор D1 во время болезни центральной нервной системы. Мы исполняли Роман РНК в situ гибридизация пробирного визуализировать одной молекулы РНК в области конкретных мозга.
В центральной нервной системе подтип рецепторов D1-альфа (Drd1α) является наиболее распространенных рецептора допамина (DA), которая играет жизненно важную роль в регулировании нейрональных роста и развития. Однако лежащих в основе Drd1α рецептор аномалии посреднической поведенческих реакций и модулирует функции памяти рабочих механизмов по-прежнему неясны. С помощью Роман РНК в situ гибридизация пробирного, текущего исследования определили допамина Drd1α рецептор и тирозина гидроксилазы (TH) РНК выражение от связанных с DA цепь в nucleus accumbens (NAc) области и региона substantia nigra (SNR), соответственно. Drd1α выражение в Североатлантическом совете показывает «дискретные точка» окрашивание шаблон. Четкие половые различия в Drd1α выражении наблюдались. В противоположность этому й показывает шаблон «кластерной» окрашивание. Что касается й выражение самок крыс отображается выражение выше сигнала на ячейку относительно Мыжские животные. Представленные здесь методы предоставляют Роман в situ гибридизация техника для изучения изменений в дисфункции системы допамина при прогрессировании заболевания центральной нервной системы.
Дисфункция системы допамина полосатой участвует в прогрессии клинические симптомы, наблюдаемые в нескольких нейрокогнитивный заболеваний. Приемные устройства допамина D1 присутствуют в префронтальной коре (ПФУ) и полосатой регионах мозга и сильно влияние когнитивные процессы1, включая рабочей памяти, временной обработки и тепловоз поведение2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. предыдущие исследования раскрыты, что изменения приемные устройства допамина D1 были связаны с прогрессированием внимания гиперактивности дефицита расстройства (СДВГ)8, нейрокогнитивный Симптомы шизофрении9, 10 и стресс восприимчивость11. Конкретно в шизофрении, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) исследования показали, что способность привязки D1 рецепторы допамина в префронтальной коре высоко была связана с познавательных дефицитов и наличие негативных симптомов11. Дендритных рост возбуждающих нейронов в префронтальной коре, регулируется рецептора допамина D1 снимает стресс восприимчивости. Кроме того сногсшибательно рецептор D1 в медиальной префронтальной коры головного мозга (mPFC) нейронов может повысить социальный поражения стресс индуцированного социальной избежания12.
Здесь мы представляем Роман технику РНК в situ гибридизация визуализировать одной молекулы РНК в клетке с образцами тканей свежемороженые. Настоящий метод имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, которые существуют в рамках текущей литературы. Во-первых нынешняя процедура сохраняет контекст пространственных и морфологических ткани и была исполнена на образцы тканей свежемороженые так, что другие процедуры, требующие свежие, невстроенный тканей могут быть объединены с текущими методами. Аналогичные процедуры в формалин исправлена и парафин врезанных тканей показали, что один транскрипции урегулирование может быть достигнуто с помощью РНК в situ гибридизация техника13. Обнаружение на уровне одного транскрипции РНК предоставляет улучшенные чувствительность к низкой копии номер выражения, а также возможность сравнить экспрессии генов на уровне отдельных ячеек, которые не могут быть достигнуты другими методами обнаружения нуклеиновой кислоты, такие методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того текущий метод поддерживает изображения с высоким соотношением сигнал шум через весьма специфические РНК зонды которые гибридизированных к одной цели РНК стенограммы и последовательно связаны с Каскад молекул усилители сигнала для обнаружения системы. Наконец настоящий технология обеспечивает возможность оценить несколько биологических систем с ее целевой объект специфического несвободных зондов, а не ограничивая наши расследования только один класс маркеров, связанных с системой, например обнаружение белка методы иммуногистохимии.
В нашем исследовании мы использовали этот роман РНК в situ гибридизация для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в Substantia (SNR) F344/N крыс обоего пола. Инновационный РНК в situ гибридизация позволило нам изучить механизмы, влияющие на поглощение да и да релиз одновременно, улучшение нашего понимания сложности системы полосатой да. Здесь, мы описать процедуру свежемороженые мозга ломтиками и предоставляют методы анализа данных для различных шаблонов окрашивание: «дискретные точка» или «группы».
В этом протоколе мы описываем Роман технику в situ гибридизация свежемороженые мозга фрагментов для оценки Drd1α экспрессии рецепторов в прилежащем ядре (NAc) и тирозина гидроксилазы (TH) выражение в регионе nigra substantia (SNR). Мы также предоставляем методы анализа данных для различных шаблон?…
The authors have nothing to disclose.
Настоящей работы были поддержаны национальные институты здравоохранения (NIH) грантов, HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624. Частичные фонд оказали NIH T32 обучения Грант в биомедицинских и поведенческих наук.
HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |