זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי
Summary
זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.
Abstract
מערכת העצבים המרכזית, הקולטן סוג D1-אלפא (Drd1α) הוא הקולטן דופמין (DA) הנפוץ ביותר, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות עצביים צמיחה והתפתחות. עם זאת, המנגנונים חריגות קולטן Drd1α תיווכה תגובות התנהגותיות, להתכוונן פונקצית זיכרון העבודה הם עדיין לא ברור. באמצעות ה-RNA הרומן בחיי עיר הכלאה assay, המחקר הנוכחי מזוהה דופמין Drd1α קולטן טירוזין hydroxylase (ה) RNA והביטוי של המעגלים הקשורות DA גרעין האקומבנס (NAc) אזור ואזור הסובסטנציה ניגרה (SNR), בהתאמה. Drd1α ביטוי ה-NAc מראה “דיסקרטית נקודה” צביעת דפוס. מין ברורים ההבדלים בביטוי Drd1α נצפו. לעומת זאת, תאנון מציג תבנית מכתימים “אשכולות”. לגבי ביטוי TH, חולדות נקבות מוצגים ביטוי האות גבוה יותר בכל תא יחסית חיות זכר. השיטות המובאות כאן מספקים טכניקה הכלאה הרומן בחיי עיר חוקרת שינויים בתפקוד מערכת הדופמין במהלך ההתקדמות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.
Introduction
תפקוד לקוי של מערכת הדופמין striatal מעורב ההתקדמות של סימפטומים קליניים שנצפתה במספר מחלות נוירוקוגניטיבי. קולטני D1 דופמין נוכחים קליפת המוח הקדם חזיתית (PFC) והאזורים striatal של המוח ולהשפיע בכבדות תהליכים קוגניטיביים1, כולל עבודה זיכרון, עיבוד טמפורלית ו-2,קטר התנהגות3 , 4 , 5 , 6 , 7. מחקרים הקודם הובהר כי שינויים של קולטני דופמין D1 היו קשורים עם ההתקדמות של תשומת לב קשב (ADHD) הפרעת8, הסימפטומים נוירוקוגניטיבי סכיזופרניה9, 10 והלחץ הרגישות11. באופן ספציפי, בסכיזופרניה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מחקרים ציינו כי היכולת מחייב של רצפטורים D1 דופמין cortices הקדם חזיתית היה מאוד קשור קוגניטיבית ואת נוכחותם של סימפטומים שליליים11. הגידול דנדריטים של נוירונים סינאפסות בתוך קליפת המוח הקדם חזיתית מוסדר על ידי רצפטור דופמין D1 מקלה על רגישות ללחץ. יתר על כן, נוקאאוט של קולטן D1 בנוירונים המדיאלי הקדם חזיתית בקליפת המוח (mPFC) יכול לשפר מפגינות הימנעות חברתית מפלה חברתית12.
כאן, אנחנו מציגים טכניקה הרומן של RNA בחיי עיר הכלאה להמחיש יחיד מולקולות RNA בתא עם דגימות רקמה מוקפאות. הטכניקה הנוכחית יש מספר יתרונות על פני שיטות הקיימות בתוך הספרות הנוכחי. ראשית, ההליך הנוכחי המשמרת את ההקשר המרחבי, מורפולוגיים של הרקמה, בוצעה על דגימות רקמה מוקפאות כך הליכים אחרים הדורשים טריים, רקמות-מוטבע יכול להיות משולב עם השיטות הנוכחי. נהלים דומים ברקמות פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע יש מאויר כי הרזולוציה שעתוק יחיד המתאפשר באמצעות של RNA בחיי עיר הכלאה טכניקה13. זיהוי של RNA ברמת שעתוק יחיד מספקת רגישות מעולה ביטוי מספר עותק נמוך, כמו גם את ההזדמנות להשוות ביטוי גנים ברמה של תאים בודדים, כי אינה יכולה להיות מושגת על ידי שיטות זיהוי חומצות גרעין אחרות, כגון טכניקות (PCR), תגובת שרשרת של פולימראז. בנוסף, השיטה הנוכחית שומרת על תמונות עם יחס אות לרעש גבוה דרך הגששים RNA ספציפי מאוד hybridized אל יעד בודד RNA תעתיקים, והוא מחויב ברצף עם מפל של מולקולות איתות הגברה זיהוי מערכת. לבסוף, הטכנולוגיה הנוכחי מספק הזדמנות להעריך את מספר מערכות ביולוגיות עם הגששים קניינית שלה במטרה, במקום להגביל את החקירה שלנו לכיתה אחת בלבד הקשורות למערכת סמנים כגון זיהוי חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה שיטות.
במחקר שלנו, השתמשנו הזה RNA הרומן בחיי עיר הכלאה להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc), טירוזין hydroxylase (ה) ביטוי הסובסטנציה ניגרה (SNR) של חולדות F344/N גם זכר וגם נקבה. RNA חדשני בחיי עיר הכלאה אפשרה לנו לחקור את המנגנונים המשפיעים על ספיגת DA והן שחרור דא בו זמנית, שיפור ההבנה שלנו של המורכבויות של המערכת striatal DA. כאן, אנו מתארים את ההליך עבור המוח קפוא טרי פרוסות ולספק שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: “dot דיסקרטית” או “אשכולות”.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה הרומן של הכלאה בחיי עיר פרוסות המוח מוקפאות להעריך ביטוי הקולטן Drd1α גרעין האקומבנס (NAc) וביטוי hydroxylase (ה) טירוזין באזור הסובסטנציה ניגרה (SNR). כמו כן אנו מספקים שיטות ניתוח הנתונים עבור צביעת דפוסים שונים: “dot דיסקרטית” או “אשכולות”.
השלבים הק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודות הנוכחי נתמכו על-ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HD043680, MH106392, DA013137 ו- NS100624. קרן חלקית סופק על ידי מענק הכשרה NIH T32 במדעים ביו-רפואית-התנהגותי.
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neurosciences. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neurosciences. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
