레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가
Summary
우리는 동시에 기계적 테스트 설명 하 고 절연, 동맥 벽의 3D 이미징 라이브 인간의 저항 동맥, 및 엘라 스 틴과 콜라겐 공간 조직 및 볼륨 밀도의 정량화에 대 한 피지 및 Ilastik 이미지 분석. 우리는 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 이러한 데이터를 사용 하 여 논의.
Abstract
저항 동맥 개장의 병원 성 기여는 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군에서 설명 됩니다. 조사 및 건강 및 질병에 있는 인간의 저항 동맥의 기계적 성질을 이해 하기 위한 microstructurally 동기 수학적 모델의 개발을 이해를 돕기 위해 잠재력을가지고 어떻게 질병 및 치료 인간의 미세 혈관을 영향을 줍니다. 이러한 수학적 모델을 개발, microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 해독 하기 위해 필수적 이다. 이 작품에서는, 우리는 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 레이블-무료 3 차원 영상에 대 한 vivo 예 방법을 설명합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 측정 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 adventitial 콜라겐 직진도 피지 및 Ilastik 소프트웨어를 사용 하 여 결정 ii) 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 사용 하 여 i) 압력 유도 된 변화에 대 한 설명 합니다. 그러나 가급적 모든 기계 및 이미징 측정 라이브, 끼얹는다 동맥에 수행 됩니다, 그리고, 다시 가압된 혈관의 후 고정 이미지와 표준 비디오 현미경 압력에에서 myography를 사용 하 여 다른 접근 방법 논의 했다. 이 대체 방법은 분석 방법에 대 한 다른 옵션이 있는 사용자를 제공 한다. 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미지 데이터의 포함을 논의 하 고 향후 개발 및 추가 프로토콜을 제안 하는.
Introduction
병원 성 기여 및 저항 동맥 리 모델링의 효과 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군1,2,3,,45에 설명 되어 있습니다. Microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 파악 하는 것은이 협회의 수학적 모델을 개발 하기 위한 필수적입니다. 이러한 모델 리 모델링 프로세스를 이해 하는 것을 향상 됩니다 고 철 모델 동맥 벽의 개장 대상 질환 관련 약리 전략을 테스트 하는 데 유용의 개발을 지원 합니다.
동맥 벽의 마이크로아키텍처 기계적 측정을 통합 하 여 동맥 벽 역학에 관한 방법과 마이크로아키텍처는 세포 외 기질 (ECM)의 대형에서 거의 독점적으로 수행 이해에 초점을 맞춘 사전 연구 쥐 또는 돼지6,7,,89,10,11에서 탄성 도관 동맥. 벽의 마이크로 구조의 화상 진 찰은 일반적으로 콜라겐, 엘라 스 틴과 제 2 고조파 발생의 autofluorescence를 활용 하는 비선형 광학 기술을 사용 하 여 수행 됩니다. Spatiotemporal 이미징을의 기질, 엘라 스 틴과 콜라겐, 얼룩이 지기를 위한 필요 없이 두 가지 주요 구성 요소 수 있습니다. 영상 전체 두께에 동맥 벽의 큰 도관 동맥 두꺼운 tunica 매체에 있는 빛의 분산 때문에 도전 이다. 그러나 어떻게 동맥 벽의 구조적 구성 요소의 마이크로아키텍처 관찰된 기계적 성질에 관련 된 결정, 3 차원 정보는 기계적 테스트 하는 동안 얻어야 합니다. 인간의 대동맥 같은 큰 동맥이 필요 합니다 biaxial 장착, 기계적 테스트 및 동맥 벽7,,910, 의 1-2 cm2 조각에 관심 영역의 이미징 12. 벽의 일부만 몇 군데 및 기계적으로 테스트할 수.
어떤 종류의 작은 동맥에 대 한 (예를 들어, 인간의 pericardial13, 폐14 및 피하15 동맥, 쥐 mesenteric 동맥16,,1718, 19 , 20, 마우스 cremaster, mesenteric, 대뇌, 대 퇴 및 경 동맥21,22,23,,2425,26, 전체 벽 두께의 27) 이미징이 가능 하며 기계적 테스트와 결합 될 수 있다. 기계적 성질 및 벽에서 구조적 조치의 동시 녹음 수 있습니다. 그러나, 직접 수학적 모델링 ECM의 3 차원 구조에서 관찰 된 변경 및 저항 동맥 벽의 변경 된 기계적 성질 사이 관계의 우리의 지식의 최선을 보고 되었습니다 따라 최근 인간의 저항 동맥13,15.
이 작품에서는, 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 3-차원 영상 비보 전 방법을 설명 합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 및 adventitial 콜라겐 직진도13 피지28를 사용 하 여 측정을 얻기 위해 설명 합니다. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 Ilastik 소프트웨어29 를 사용 하 여 결정 하며 마지막으로, 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미징 데이터를 포함 합니다.
설명 하는 수학적 모델링을 함께 기술 조사 설명 하 고 이해 하는 체계적인 접근 방법을 제공 하는 영상 및 이미지 분석의 목표는 저항 동맥의 ECM에 압력 유도 된 변화 관찰. 설명된 방법 20, 40, 100 mmHg에서 ECM의 구조를 비교 하 여 가압, 동안 선박에 ECM에 변화를 측정에 집중 된다. 이러한 압력은 각각의 더 준수 (20 mmHg), 뻣 뻣 한 (100 mmHg) 및 중간 (40 mmHg) 상태에서 동맥 벽의 구조를 결정 하기 위한 선정 됐다. 그러나, vasoactive 구성 요소, 히스테리시스 및 흐름에 의해 유도 된 변화를 포함 하 여 라이브 동맥의 혈관 벽에 어떤 과정 든 지 수 측정할 수, 조사 하 여 문제의 연구 가설에 따라.
라이브 동맥의 압력 (또는 다른) 유도 공부 하 고 변화는 ECM에 대 한 압력 myograph와 함께에서 2 광자 여기 형광 현미경 (TPEM)의 사용을 강조 했다. 첫째,이 동시 취득은의 높은 품질의 3 차원 레이블 없는 인수와 함께 동맥 벽 (직경 및 벽 두께)의 전체 3 차원 구조를 사용 하면 때문에 상세한 콜라겐과 엘라 스 틴의 이미지 엘라 스 틴 autofluorescence 및 콜라겐 두 번째 고조파 발생 신호 (SHG)30의 활용 하 여 설명13 마이크로아키텍처가. 둘째, TPEM 수 저-에너지 근처-적외선 여기 빛, photodamage 조직과 따라서, 혈관 벽 내에서 정확 하 게 동일한 위치에서 반복된 이미지의 최소화는 허용, 허용 반복 측정 분석의 관찰 변경합니다.
고정 동맥 압력의 공초점 이미지를 사용 하 여 다른 접근 방법의 사용 TPEM에 액세스 하지 않고 사용자가 뿐만 아니라 설명된 메서드를 사용 하는 기회 수 있도록 설명 되어 있습니다. ECM 구조와 볼륨 밀도 대 한 정보 예:31,32에 의해 설명 된 대로 직렬 구분 조직의 2 차원 분석에서 검색할 수 있습니다. 그러나,이 메서드를 사용 하 여 상태를 변경 하는 동안 뿐만 아니라 동맥의 길이 비늘 통해 3 차원 구조 정보를 검색 하는 가능성의 부족, 그것은 압력의 수사를 위해이 접근을 사용 하 여 권장 하지 고 치료는 ECM에서 3 차원 변화를 유도 한다.
여기에서 설명한 메서드를 적용할 수 사관에 대 한 최소 요구 cannulation 및 형광 현미경 confocal 또는 2 광자 여기와 함께에서 동맥의 가압에 대 한 설치 프로그램에 액세스입니다. 다음 프로토콜에서 설명 하는 설치 사용자 지정 내장된 거꾸로 2 광자 여기 형광 현미경에 내장 경도 힘 변환기와 맞춤식 압력 myograph 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품이 나타냅니다 접근을 위한 표준화 된, 결합 된 이미징 및 압력 myography, 저항 동맥과 압력 관련 된 변화는 동맥의 구조에서의 기계적 특성의 동시 평가 대 한 귀중 한 우리의 제안을 0에서 100 mmHg의 압력 범위 벽. 그러나 제시 방법은 사용자 지정 건설된 장비를 사용 하 여 개발 되었다,, 어떤 압력 myograph 2 광자 여기 형광 현미경에 맞는 경우 사용할 수 있습니다, 두 장비의 디자인 수 동맥 벽?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 실험실과 현미경의 사용에 대 한 덴마크어 분자 생체 이미징 센터에서 학부의 자연과학 대학 남부의 덴마크를 감사합니다. Myography 및 이미징 Kristoffer Rosenstand 및 Ulla Melchior에 압력을 가진 우수한 기술 지원을 인정 됩니다.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
