Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения
Summary
Здесь мы представляем протокол определить специфику протеазы в сырой мыши ткани экстрактов с помощью MALDI-TOF спектрометрии.
Abstract
Протеаз имеют несколько биологических функций, включая активации/дезактивации и продовольствия переваривания белка. Выявление специфики протеазы имеет важное значение для выявления протеазы функции. Метод, предложенный в настоящем исследовании определяет специфику протеазы, измеряя молекулярная масса уникальных субстратов с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Субстраты содержат иминобиотин, а рассеченного сайт состоит из аминокислот и разделитель состоит из полиэтиленгликоля. Расколотые субстрат будет генерировать уникальный молекулярный вес с помощью рассеченного аминокислоты. Одним из достоинств данного метода является, что он может осуществляться в одном горшке с использованием сырой образцов, и он подходит также для оценки нескольких образцов. В этой статье мы опишем простой экспериментальный метод, оптимизированные с образцами, извлеченные из мыши легочной ткани, включая добычу ткани, размещение пищеварительной субстратов в образцы, очищение пищеварительной субстратов в условиях различных рН и измерение субстратов молекулярный вес с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Таким образом эта техника позволяет для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF, который легко может быть расширена для обработки нескольких образцов.
Introduction
Протеаз регулировать физиологические процессы раскалыванием белков, и начало деятельности протеазы в определенное время и местах регулируется1. Поэтому важно определить выражение и активность тканей, которые регулируются на местном уровне и разработать новый метод для обнаружения протеаз. Предлагаемый метод в это исследование направлено на выявление специфики протеазы параллельно для обнаружения протеаз.
Есть несколько методов для обнаружения протеазы специфичности. Метод azocasein well-known для его использования в обнаружении протеаз2 , но ограничены в своей способности для получения дополнительной информации. Зимография является еще одним методом обнаружения всеобъемлющей протеазы, который может использоваться для определения молекулярная масса протеаз3, но он не может использоваться для изучения субстратная специфичность. Специфика протеазы может определяться спектрометрический анализы, используя субстратов, например4p-nitroanilide и флуориметрический анализов, используя кумарин субстратах5 или анализов флуоресценции передачи энергии резонанса (ЛАДА)6. Эти методы позволяют сингл специфичность обнаружения субстратов, содержащихся в одной скважине. В настоящем исследовании специфика протеазы ткани экстрактов рассматривается в различных условиях, как эти экстракты содержат несколько протеаз. Протеазы деятельность регулируется рядом факторов, включая рН, коферменты, протезно групп и ионная сила. Недавно на основе протеомики методы были использованы для выявления специфики протеазы; например метод сообщает Biniossek и др. 7 использует протеома для определения субстратная специфичность даже в сырой экстрактов и позволяет точное определение расщепления активности протеаз, которые признают несколько аминокислотных последовательностей8. Однако этот метод не подходит для анализа многочисленных образцов. В противоположность этому, наш метод позволяет одновременной обработки нескольких образцов, а также использование Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для анализа проб облегчает быстрое и простое обнаружение рассеченного субстраты.
Этот документ описывает метод для оценки специфика протеаз с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF для измерения молекулярной массой уникальных субстратов. Молекулярные формы рассеченного субстратов, а также их теоретической молекулярным весом, показаны на рисунке 1 и в таблице 1. Предыдущие исследования использовали субстраты, содержащие polyglycine прокладки и биотин9; Однако эти субстраты ошибочны, потому что polyglycine последовательности может быть расщепляется ферментами, которые признают глицин последовательности. Кроме того высокое сродство между авидином и биотина может привести к низкой восстановления курса. Чтобы улучшить эти недостатки, в этом исследовании мы синтезированных уникальный субстрат, который состоит из полиэтиленгликоля (PEG), иминобиотин и аминокислоты, которые могли бы идентифицировать расщепления сайта (рис. 1). Чтобы различать аминокислоты подобными молекулярными весами проникли, D-Серина был добавлен между PEG распорку и аминокислот на объекте рассеченного.
N-терминальный субстрата было названо с иминобиотин, который позволяет очищение сродства от сырой образцов. Использование иминобиотин вместо биотин является критически важным; биотин имеет сильное сродство с авидин, что приводит к низкой восстановления ставок биотин меченых субстратов из авидин смолы, в то время как иминобиотин в сродство для авидин может быть изменено, рН. Иминобиотин меченых субстратов будет привязан к авидин в условиях выше pH 9, в то время как авидин выпускает иминобиотин меченых субстратов в условиях ниже рН 4. Таким образом иминобиотин был использован для очищения сродства10. В целом мы описываем подробный протокол для выявления специфики протеазы, с использованием уникальных субстратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол использует MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов и легко могут быть расширены для обработки нескольких образцов. В частности мы манипулировать рН, чтобы вызвать изменения в субстратная специфичность.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали Нихон фармацевтического университета исследовательский грант от фармацевтического университета Нихон (2016) и JP17854179 номер гранта KAKENHI МПКСНТ.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
